• ベストアンサー

ライゲーション

実験でプラスミドpUC19(約2700bp)をEcoRIで切断して、インサートDNA(約48000bpのλファージDNAをEcoRIで切断したもの)にライゲーションしたのですが、この結果どのようなDNA分子が形成されるのでしょうか?複数あるようです。 この質問内容では情報が不足していると思いますので、簡単な図みたいなもので形だけでもわかればいいのでお願いします。

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
回答No.2

lambda DNAは線形のDNAで内部に5箇所のEcoRI部位を持つので、6つの断片に分かれます。 http://www.nippongene.com/pages/products/clomod/dna_vec/lambda/lambda_1.png 各断片の長さは、laambda EcoRIマーカー(電気泳動のときのサイズマーカーとして使われる)の製品情報を見てください。 http://www.cosmobio.co.jp/product/products_FER_20060327/products_FER_20060427_others.asp これらの断片のうち、両端に位置する、もっとも長い断片と最も短い断片は、片側にしかEcoRI末端がありませんから、クローニングされないでしょう。 それら2つを除いた4断片がそれぞれ一つずつクローニングされたものと、インサートが入らなかった空のプラスミドが、もっとも予想される産物です。 そのほかにも、複数の断片同士がEcoRIで結合したインサートが入っている可能性もあります。 ただし、インサートが長いほど、取れてくる頻度が下がりますから、多く取れるもの、まれにしか取れないものがでてくるでしょう。

moshu85
質問者

お礼

かなり参考になりました。ありがとうございます。

その他の回答 (1)

  • MIYD
  • ベストアンサー率44% (405/905)
回答No.1

足りない情報は、 まずはこの質問が課題の丸投げではないということを示す情報ではないでしょうか 後は、制限酵素処理とライゲーション反応で何をしているのかをどこまで理解しているのかという情報でしょうか 簡単な図だと、 ○とーが出来ます ○の方は、 セルフライゲーション インサート1入り インサート2入り インサート3入り インサート4入り 複数のインサートやベクター入り ーの方は ライゲーションされていない断片 されている断片 になります

moshu85
質問者

お礼

返答ありがとうございました。 課題の丸投げに思われる内容でしたが、簡単な図を書くことはできたのですが、もっと詳しいことが知りたかったのです。どこまで十分なのか不明なので質問させてもらいました。

関連するQ&A

  • ライゲーションについて…。

    またまたまたまた生物化学実験について質問です。 ベクターの構築方法についてです。 タンデムリピートベクターを作製しようとしているのですが、その過程で以下の行程があります。 一、ホス トベクターの断片とインサートの断片の片方のみをライゲーション。ライゲーション産物を泳動して精製 二、ライゲーション産物について制限酵素切断を行い、精製した後にライゲーション。ここで始めて環状となる。 以上の行程で目的ベクターの完成です。しかし、一、の精製時に目的のバンドが得られず、(5.4kbp辺りです)10kbp以上の部位にフニャフニャしたバンドが薄く出ていました。ここで質問なのですが、ライゲーション反応後にすぐに泳動したりすると、何か障害とかあるのでしょうか?エタ沈やフェノクロ抽出をせずに、そのままライゲーション液を電気泳動したので。 あと、うまくいかなかった理由として何かヒントのような助言をくださると助かります。ちなみに、使った試薬はニッポンジーンのT4DNAリガーゼです。 -詳細な説明- 最初にホストベクターをXbaIで切断します。ここにインサートDNAの片方の端をライゲーションで繋ぎます。インサートDNAの配列は [NheI-(インサート)-XbaI-ApaI]となっております。XbaIの切り口NheIの切り口は相補配列です。ライゲーション後はXbaIでライゲーション産物を切断して再びライゲーションを行い、DNAの環化を起こそうとしたのですが、難しいでしょうか?

  • ライゲーション

    ベクターにinsert DNAを1種類の制限酵素でライゲーションする際,ベクターは制限酵素で切断後,アルカリ性フォスファターゼ処理をして,リン酸基を水酸基にかえてセルフライゲーションを防ぎます. しかし,この状態ではinsert DNAとベクターは2本鎖のうちの1本鎖だけでライゲーションすることになるのですか??もう片方の鎖は両方とも水酸基になっていますよね.insert DNAの方は3'-OHで,ベクター側はアルカリ性フォスファターゼ処理したので5'-OH. 実験は普通にうまくいっているのですが,原理がいまいちよく分かりません.

  • 制限酵素サイトの異なるライゲーションについて

    現在、あるベクターから別のベクターへ配列を移し替えようとしているのですが、ベクターとインサートの制限酵素サイトが合いません。ベクター側はEcoRIとBamHIで、インサート側はEcoRIとNotIで切り出したいと考えています。このような場合何かいい方法はありませんでしょうか? 現在考えているのはベクター、インサート共に両側を平滑化する方法なのですが、向きが決まらないことと、現在まで平滑末端でのライゲーションの経験がなく、研究室内でも成功率が低いので他にいい方法がないかと思っています。 もしくはインサート側をPCRで増やすことも考えたのですが、プライマー作製の時間を考えると、平滑化したほうが手っ取り早いのではないかと思っています。 また、現在まではライゲーションによって環状DNAを作ることしか行ったことがないのですが、上記のような末端を持つもの同士をライゲーションした場合、EcoRIのみで結合した直鎖状のDNAが出来るのでしょうか?もしそうなのであれば、その後末端を平滑化してさらにライゲーションするという方法もありますよね? 勉強不足で申し訳ありませんが、何かいい知恵をお持ちの方がいらっしゃいましたら拝借させていただけないでしょうか?

  • ライゲーションがうまくいかない…(~_~;)

    分子生物学の研究をしているものです。pcDNA3.1(+)というベクターをNheIとApaIで切断して、ここに自分の設計したインサートを導入しようとライゲーションを行っているのですが、なかなかうまくいかず、セルフライゲーションばかり起きてしまいます。ベクター、インサート共にゲルからの切り出し精製を行っているので、断片が混じっているようなことはないと思いますが…。ライゲーションがうまくいかない要因としてヒントを頂けると助かります。 ちなみに、ベクターとインサートのモル比を1:8,1:40,1:80,1:160でライゲーションを行いましたが、いずれもセルフライゲーションが起きていました…(~_~;)

  • 制限酵素の最低必要量の求め方

    今回、仕事でプラスミドDNAの制限酵素処理を行うことになりました。 私は分子生物学等の知識に乏しく(医療系出身ですので・・・)、いろいろな実験書や参考書を調べてみたのですがどうしてもわかりません。 うまく説明できませんので、あるページから例題をおかりしましたので、掲載させていただきます。 例題) 大腸菌 DNA を pBR322 の EcoRI 部位にクローニングする。次の問題に答えよ。但し,EcoRI 制限酵素1 unit は,λファージ DNA 1μg を,0.1M Tris・HCl,pH7.5,7mM MgCl2,50mM NaCl 中,37℃,1時間で完全に切断する活性として定義される。λファージ DNA は 50 kbp あり、EcoRI 部位は5カ所ある。 大腸菌 DNA を pBR322 の EcoRI 部位にクローニングするのに,10 μg の大腸菌 DNA を EcoRI 処理したい。必要最少量の 10 倍量の EcoRI を加えるとして,何 unitの EcoRI が必要か。反応は,37 ℃, 12 時間行うことにする。 計算方法等をわかりやすく教えていただけると幸いです。 基本的な質問で申し訳ないのですが、よろしくお願いいたします。

  • プラスミドDNAの制限酵素による切断

    プラスミドDNAを2種類の制限酵素(EcoRI)によって切断し、それをアガロース電気泳動法でDNA断片を長さによって分離する。という実験をやったのですが、失敗して結果と考察がわかりませんでした。教えてください。よろしくお願いします。

  • 平滑末端(blunt end)のライゲーション成功率

    ライゲーションを行ったのですが32個コロニーがあってやっとひとつインサートが入っているものが見つかりました。確率的には1/32ですよね。 ライゲーションの成功率ってここまで低いものなんですか? 上手な人がやればどのくらいで成功するのですか? 運なのでしょうか? インサートが入っていなかったものはベクターのセルフライゲーションが起こったものです。 ベクターの脱リン酸化も行ったのですが、 それが不十分だったのでしょうか? それともインサート:ベクターの混合比がまずかったのでしょうか? 平滑末端だったので難しい実験であることは間違いないですが。 大きさですが、ベクターが8000bp、インサートが 1500bpです。 ゲル抽出をした後の電気泳動のバンドの濃さを見て 同じ液料入れたのがまずかったのかもしれませんが。 モル比は1:1がいいんでしょうか?

  • 分子量のマーカー(DNAラダー)の移動度とサイズ(bp)の関係

    分子量のマーカー(DNAラダー)の移動度とサイズ(bp)の関係をグラフにプロットせよ。 また,そのグラフから各々のプラスミドに組み込まれていたインサートの長さを測定せよ!!!! という問題で、分子量のマーカー(DNAラダー)の移動度とサイズ(bp)の関係をグラフにプロットせよ。はで来たのですが、そのグラフから各々のプラスミドに組み込まれていたインサートの長さを測定せよ、という問題が分かりません。どうやって解けばいいのか教えてください。そもそもインサートってなんですか?

  • 今度は・・制限酵素の失活についてなんですが。。。

    毎回毎回すみません・・また実験がうまくいきませんでした・・・ プラスミドDNAをEcoRI,BamHIの二種類の制限酵素を使用し、どのように切断されるかをアガロース電気泳動を行って、バンドの移動度を比べてみました。 1つは、EcoRIだけで切断し、もう1つは二種類の酵素で切断しました。 でも電気泳動ででたバンドはネガコンとして流した未処理プラスミドDNAと同じバンドでした。通常移動度が遅くなったり、バンドが2本でるはずなのですが・・まったくありませんでした・・・ 制限酵素が失活して、切断できなかったのではないかと考察したのですが・・・酵素は熱を加えると失活してしまうため温めないように注意したのですが・・ 制限酵素が失活してしまう要因をどうか教えてください。実験で注意すべき点など教えていただければ今後の実験に役立ちます。ぜひ実験をして経験された事でもよいので教えてください。いつもいつも実験の失敗についてばかり質問してしまってすみません・・・ よろしくお願いします。

  • XhoI-SphI のライゲーション

    XhoIとSphIで1700bpのPCR産物をクローニングしようとしていますが、形質転換効率が非常に悪く、わずかに形質転換されたコロニーにもインサートは入っていません。 XhoIがPCR産物を分解しにくいという話はよく聞きますが、私は今まで別の遺伝子のクローニングに使って問題ありませんでした。今回のプライマーにも、上手くいっていた遺伝子をクローニングした時と同様、プライマーの制限酵素サイト外側に4塩基つけ、37度二時間処理しました。 XhoIは、PCR産物の違いによって、同じ条件で処理しても切れたり切れなかったりするのでしょうか。 ライゲーションの方法自体に問題がないことはコントロールで確認した上で、ライゲーションの前後のDNAをアガロースゲルに流してみました。 ライゲーション前はベクターとインサートが問題なく見え、ライゲーション後は、バンドがいくつも見えました。いくつも見えたバンドの中には、 1.インサートのバンド 2.制限酵素処理したベクターのバンドよりやや小さいバンド 3.それからサイズのもっと大きいバンドが4本 でした。 一瞬、2.のバンドはきちんとライゲーションして環状になったものかと思ったのですが、このバンドは、使用したベクターよりはるかに明るいので、インサートが連なったものと考えるべきでしょうか。(因みに使ったインサートはベクターよりかなり多い)結局はこれを見ただけではライゲーションが上手くいっているのかわかりません。 XhoIを使われて同じような経験をされた方、どうぞアドバイスお願いします。