• 締切済み

カラム精製後の泳動

PCR産物をカラムで精製し、確認の泳動をしたところ、バンドが全くありませんでした。PCR産物の泳動ではきちんとバンドがありました。自分のミスかと思い、もう一度PCRから行ってみたのですが、ダメでした。こんなことは初めてです。自分のミスなら解決できそうなのですが、その他に考えられる原因があるとしたら、教えていただきたく、質問しました。どなたか宜しくお願い致します。

みんなの回答

  • Chicago243
  • ベストアンサー率38% (401/1043)
回答No.3

PCR産物のサイズが、極端に小さくありませんか? また、本当にPCRがかかってますか?プライマーダイマーとかを精製してませんか?

回答No.2

・ヴォイドに出ていない ・レジンへの吸着 以上、憶測に基づく可能性です。

回答No.1

以下の点について補足してください。 PCR産物のサイズ カラムの種類（商品名でかまわないでしょう） 溶出液の体積 泳動サンプルの体積 泳動サンプルの調製法

  1. カテゴリ
  2. 学問・教育
  3. 自然科学
  4. 生物学

関連するQ&A

  • バンドが見えない

    PCR後、増幅していることを確認し、カラムで精製して、再度、確認として1%アガロースゲルで泳動したらバンドが確認できませんでした。これまでこのようなことはありませんでした。自分のミスかと思い、もう一度やり直したのですが、結果は同じでした。PCR産物の濃度が薄くなっているだけなのでしょうか？その他バンドが見えない原因として考えられることがあったら教えてください。宜しくお願い致します。

  • カラムの再利用(PCR産物精製)

    PCR産物をアガロースゲル電気泳動したものを切り出しして、精製するのにPromegaのKitを使用しているのですが、 このカラムを再利用したいと思っています。 再利用できると聞いたのですが具体的な方法がわかりません。 よろしくお願いします。

  • アガロースゲル電気泳動におけるPCR産物バンドの乱れ

    　600 bpくらいのDNA配列をPCRで増やし、その産物をPEG沈して精製しているのですが、PCR直後の電気泳動（1.5% TBE gel)では1本のバンドなのですが、PEG沈後の電気泳動では2本になっています。 　分子量で見ると、産物のバンド（600 bp）に加えて、450bp程度のバンドが新たに出現します。精製中に分解したのでしょうか？（でも、DNaseのコンタミだったらもっとズタズタに切れますよね）。それとも、精製過程で産物の一部が何か高次構造のようなものをとって、電気泳動上で二本になって見えるのでしょうか？ 　原因についてご存知の方、あるいは同じ経験をされた方、教えてください。

  • PCR＆電気泳動について

    電気泳動について質問です。3種類のプラスミドDNAについて、同じプライマーを用いてPCRを行いました。このバンドを電気泳動してみたところ、2種類のプラスミドDNAに関してはクッキリと目的バン ドが出たのですが、残り1種類のプラスミドDNAの増幅産物にかんしては、薄い目的バンド➕スメアが観察されました。この原因として考えられるのは何でしょうか？自分が考えているのは、プライマーや酵素には問題がないと思うので(他2種類のプラスミドDNAのPCRはうまくいった。)、テンプレートのプラスミドDNAの精製度が低いと考えています。現にO.D値も1.72くらいだったので…。なので、プラスミドDNAの抽出からやり直そうかと考えています。 他に何か考えるべき要因があれば、ご教授お願いします！

  • アガロースゲル電気泳動

    現在、実験でアガロースゲルを用いて電気泳動を行なっています。 しかし、ポジティブコントロールは毎回バンドがでるのですが、目的とするバンドの方は、帯状にPCR産物が流れた跡のようなものが出るのみで、バンドが出なくなってしまいました。 1ヶ月くらい前まではきちんとバンドが出ていたので、プライマーの設計ミスでもなさそうなのですが、何が原因なのか分からず困っています。 PCRをかける前のDNAは10ng/μLで、実際電気泳動で流しているDNA濃度は測定していないため、分かりません。 ちなみに電気泳動の条件は以下のとおりです。 ・ゲル：1.5%アガロースゲル ・電圧：100V どなたか知恵を貸してください。 実際の電気泳動後の写真は、 http://oshietegoopcrdenkieidou.rakurakuhp.net/ に載せました。 よろしくお願いします。

  • アガロースゲル電気泳動でサンプルがウェルにスタック

    PCR産物（2.5kb）の確認のためにアガロースゲル電気泳動を行っています。しかし、サンプルがウェルにスタックしてしまって、うまく流れてきません。マーカーはきれいに流れています。マグネシウム濃度を振ってPCRをしたのですが、マグネシウム濃度が高いサンプルほどウェルの付近ははっきりと光っているので、実はPCRはうまくいっているのではないかと考えています。どうやったらきれいに流すことができるのか教えてください。また、PCR産物をPCR-purification kitなどで精製して流すと改善されたりするのでしょうか？

  • アガロースゲル電気泳動時にサンプルやマーカーが浮いてしまいます。。。

    アガロースゲル電気泳動を行ってDNAやPCR産物のバンドを検出する際に、アプライしたサンプルやマーカーが泳動中にゲルから浮き出てしまい、解析できないことがしばしばあります。 dyeはBPBを使用していて、100Vで30分ぐらい泳動していますが、10分ぐらいでゲルに青色のバンドが全く残っていないという現状です。 バッファーは１×TBE,ゲルも１×TBEで１～２％アガロースゲルを通常毎回作成して使用しています。 サンプルの精製度が悪ければ浮いてくるという話は聞いたことがありますが、マーカーも浮いてきてしまうので原因が全くわかりません。 ほかの人は同じマーカーを使用していてもこのような現象はないということです。 ゲルの作成方法に問題があるのかと考えましたが、全くわかりません。 考えられる原因をいろいろと教えていただければ、大変助かります。 どうぞよろしくお願い致します。

  • PCR産物を電気泳動すると・・・

    PCR産物を電気泳動すると、ひきずって流れているように筋のようなものができて流れていきます。 バンドも見えるのですが、筋があるのではっきりとは見れません。 ちなみにゲルはすでに作られているものを用いているので、ゲル以外に原因があると思っています。しかし、PCRにかけるときはプライマーとDNAとmilliQしか入れていません。 同じような経験がある方、原因がわかる方いらっしゃったらお願いします。

  • アガロースゲル電気泳動の失敗

    作った１枚のアガロースゲルを使うレーン分だけ切り分けPCR産物を泳動したのですが、なにもでませんでした。先に使用したサンプルはマーカーもバンドも確認できました。 同じゲルで同じマーカーを使用したのに、なぜこんな事になったのでしょう？？どなたか教えて頂けないでしょうか？宜しくお願いいたします。

  • DNA断片をPCRで増幅し、増幅したものを電気泳動で確認するとバンドが

    DNA断片をPCRで増幅し、増幅したものを電気泳動で確認するとバンドが確認できました。 そのPCR産物を使ってベクターにサブクローニングしたのですがまったくライゲーションできませんでした。 用いた方法はTAクローニングシステムです。 なぜサブクローニング出来なかったのか考えているのですが、PCR反応の際に用いたDNAポリメラーゼが3'にアデニンをうまく付加出来ないということはありえるのでしょうか？ 他に原因が思い浮かびません。 どなたかアドバイスいただけないでしょうか。 よろしくお願いいたします。

注目のQ&A

カテゴリ

専門家に質問してみよう

職業から探して質問する

あなたにピッタリな商品が見つかる！ OKWAVEセレクト

質問する