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immunoscreeningの発色
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プラークのブロットの具合、培地によるメンブレンの汚れ具合、溶菌のさせ方などによって、シグナルの強さや、S/Nがばらついたりしますね。スメアになるのは、こすれたり、溶菌のときに液が多すぎて流れたりしたときになどに起こります。 それと、抗体反応のときの液のあたり具合が影響します。何枚ものメンブレンを同時にインキュベートしたりすると、重なり具合で仕上がりがずいぶんばらつきます。 それと、アルカリフォスファターゼは感度が高いのですが、バックグラウンドも出やすいです。一つには、大腸菌の内在性の酵素が効いてきますし、NBT/BCIPも長時間の反応では、ごく低いノイズにも（ノイズすらないところでも）発色してしまいます。感度は一桁くらい落ちますが、パーオキシダーゼで検出したほうがS/Nはいいかもしれません（発色ではなくルミノール発光を使えば、感度はあがります）。 蛇足ですが、＃1さんの大腸菌ライセート云々は、大腸菌で発現させたたんぱく質で免疫した抗体を使う場合です。大腸菌そのもののたんぱく質に対する抗体もできていて、すべての大腸菌と反応してしまう場合のことです。
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- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
>パーオキシダーゼで発光というのは?何かいい本がありますでしょうか? アマシャムのECLシステムが、古くから使われていて、今でも廃れずに残っているので、信頼性が高いと思います。
お礼
どうも有り難うございます。 やってみる価値がありそうです。 HRP標識の抗体を買ってやってみます。
- meineko
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陰性のプラークも染まってしまい、陽性との差が少ないということでしょうか？ それとも、陽性の方も弱くしか出ないということでしょうか？ 前者なら、ブロッキングやwashの条件を工夫して、陰性のプラークに色が出ない様な条件を見つけてみてはどうでしょうか？ あと、抗体はどのようにして作られたものですか？大腸菌で発現させた抗原を元に作った抗体などで、時々、大腸菌のタンパク質とも反応してしまうものがあります。そういう時は、ブロッキングの時に大腸菌のラーセートを加えてやると、バックグラウンドを減らせます。 後者の場合、培養時間等の条件を変えてみると、発現量が稼げるかもしれません。 とりあえず、不確かなプラークまでみんな拾って、二次スクリーニングを行うというのも、手かもしれません。
お礼
有り難うございます。 参考になりました。
補足
どうも有り難うございます。いくつか重ねて質問させてください。 陽性との差が少ないのです。マニュアル通り、ブロッキングはTBST+ゼラチン1%、washはTBSTで行っているのです。 大腸菌のラーセートを加える、というのは具体的にはどうするのですか?一晩液体培地で培養し、10mMMgSO4でストックしてある大腸菌(ファージに感染させるのに使うやつですね)を一次抗体とのインキュベートの時に加えるということでしょうか。 不確かなプラークも含めて拾いたい、のですが、発色後にメンブレンを引き上げると、何だかプラークの周りにしっかり円周上に色が付いているのではなくて、ぼやぼやっといくつかのプラークにまたがってスメアのように見えるときもあります(説明が難しいのですが)。そういうようなときはありますか?
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