DNAが消えた！組織から回収したDNAが失われた理由は何か？
- 組織から回収したDNAが濃度が低かったため、再度クロロフォルム処理を行いました。
- DNAの濃度を濃くするために再度エタ沈を行ったところ、DNAが失われました。
- 最後のエタ沈の過程で操作ミスがあり、DNAが回収できなかった可能性があります。
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DNAが消えた！
組織からDNAを採取し、フェノール→フェノクロ→クロロフォルム処理→エタ沈で回収したDNA（DNA(1)）がちょっと薄かったので、クロロフォルムに残った層から再度回収して（DNA(2)）、最初のDNAに混ぜました（DNA(1)＋(2)）。volumeを減らして濃度を濃くしたかったため、再度エタ沈したところ、DNAがなくなってしまいました（泣）(1)と(2)は濃度を測定して50ng/ul前後ありました。しかし、(1)＋(2)は100ng/ulぐらいはあるはずが、0.1ng/ulしかないんです。最後のエタ沈は、TEと1/10量の3M酢酸ナトリウム、2.5倍量のエタノールを入れて混ぜ、-80℃15分、遠心12000rpm 30minしました。70%EtOHでリンスする時に遠心機利用が他の実験者とバッティングしたため、10分くらい70%EtOHを入れたままおいてしまいましたが、4℃12000rpm10min遠心して乾燥させ、TEに溶解しました。DNAが回収できなかったのは、どこがいけなかったんでしょうか？
- hippocampi
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考えれば可能性は沢山あります。 しかし、よく初心者にありがちな失敗としては エタ沈で最後に70%エタノールでリンスするときです。 DNA沈殿物は、70%エタノールではチューブの底からはがれやすく 注意して70%エタノールを除かないと、DNAも一緒に捨ててしまいます。 遠心するときに、チューブの向きをいつも同じにしておいて 見えないDNA沈殿物であっても「ここの底にあるはず」と念頭におきながら 注意深く70%エタノールを除く必要があります。 また、エタ沈はDNAの量が少なくなればなるほど、回収率は悪くなります。 こういうものが売ってあるくらいです。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100004325
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お礼
ご回答いただきましてありがとうございました。チューブの向きは揃え、沈殿物がある場所にDNAがあると信じてエタ沈しました。。微量の試料からDNAを均一に回収したかったので（genomic DNA、計30サンプル）、ばらつきを抑えるためにエタ沈の際は静かにデカンティングをして上清を捨てていました。ピペットマンで上清を注意深く除きたいところですが、サンプルがたくさんあったので後ろのサンプルの沈殿物浮上が心配で、、、いままではうまく回収できていたのですが、今回ばかりは初めて70%EtOH（しかも常温）を加えて10分も放置、あーー最後の最後で悔しいです。グリコーゲンを使うと濃度が変わってしまうので使用していませんでした。タカラバイオの製品は、グリコーゲンより安価で回収率がいいようですので、試してみようと思います。情報ありがとうございました！
補足
ご回答いただきましてありがとうございました。チューブの向きは揃えて沈殿物がある場所にDNAがあると信じていました。。微量の試料からDNAを均一に回収したかったので（genomic DNA、計30サンプル）、ばらつきを抑えるためにエタ沈の際はデカンティングで上清を捨てていました。ピペットマンで上清を注意深く除きたいところですが、サンプルがたくさんあったので後ろのサンプルが心配で、、、いままではうまく回収できていたのですが、今回ばかりは初めて70%EtOH（常温）を加えて10分も放置、あーー最後の最後で悔しいです。今度はぜひタカラバイオの製品を試してみようと思います。情報ありがとうございました！