• 締切済み

rabbitで作られた2種類の一次抗体でで組織切片に対して二重免疫染色

rabbitで作られた2種類の一次抗体でで組織切片に対して二重免疫染色をしたいのですが、どのような方法があるでしょうか?

みんなの回答

  • nayu-nayu
  • ベストアンサー率25% (967/3805)
回答No.1

動物種の違う1次抗体を用意できれば理想ですが、やむを得ないならZENON標識でしょうか。

関連するQ&A

  • 免疫組織染色.抗体タグは種類によって何が違う?

    生物学初心者です. 抗体タグについていくつかわからないことがあります. アドバイスをいただけると幸いです. 免疫組織染色に使用する抗体タグには, 6xHis,HA,c-Myc,FLAG,GFP などを代表して,約30種類前後あると思います. これらのタグの違いとして, サイズ(アミノ酸残基数)が違うのは自明です. わからないこと - 具体的にどんな性質の違いがあるのでしょうか? - 染色方法に寄って使い分けるのでしょうか? - タグ間に良し悪しがあるんでしょうか? - マウスやハエなど宿主によって適切なタグは変わるのでしょうか?

  • 免疫組織染色法の結果について

    同じパラフィンブロックから薄切された切片を、同じ実験方法を用いて免疫組織染色した場合、結果が異なる(染まるor染まらない)ことがあるのでしょうか? また、あるとすればどういったことが考えられるのでしょうか? 私の場合、以前行った実験では染まり、今回行った実験では染まらないという結果になってしまい当惑しております。 免疫組織染色の初心者ですが、ご教授下されば調べて理解に努めますので、よろしくお願いします。

  • 免疫染色時の1次抗体・2次抗体の濃度

    免疫染色初心者です.よろしくお願いします. 血管内皮細胞,線維芽細胞,心筋細胞の特異的タンパクを染めるのに,Von Willbrand factor(rabbit),DDR2(rabbit),α-actinin,2次抗体としてgoat anti-rabbit IgG等の抗体を用います.こういう場合の1次・2次抗体の濃度はやはりある程度100倍,1000倍なり自分で希釈してみて決めるしかないのでしょうか?他の方の質問も拝見して,自分で調べるしかないのかなとは思いましたが,どの濃度で一番反応が出やすいというのはないのでしょうか.よろしくお願いいたします.

  • 免疫組織染色とDAPI について

     現在、核に局在すると推定しているタンパク質について免疫組織染色解析を行なっています。そこで、あわよくば細胞内局在まで見てやろうと思い、発色後の組織をDAPIで染色して観察しているのですが、どうも免疫染色のシグナルが強い切片ほどDAPIの蛍光が弱いのです。(DAPIは、ネガコンのpreabsorbedで最も良く染まり、次に抗体希釈条件によって免疫染色シグナルが弱いものが染まりやすいです。強く発色させたものでは、前二者で染まっていた細胞でも全くDAPI蛍光が観察できなかったりします。)  そこで、質問なのですが、核にあるタンパク質に結合した一次・二次抗体および標識タンパク質や発色物質によってDAPIの浸透が阻害されるようなことはありえるのでしょうか?  必要そうな諸条件を以下に書きます。 ・ブロッキング:10%(w/v) BlockAce, 10%(v/v)ヤギ正常血清 in PBS ・一次抗体希釈液:0.3% PBS-BSAまたはCan get signal solutionA(TOYOBO) ・二次抗体:ビオチン化抗ウサギIgGヤギ抗体 ・ABCキット:VECTASTAIN Elite ・発色試薬:DAB(Niは使用しない) ・DAPI染色:1 ug/mlで5 min(遮光) ・封入:余分なDAPI溶液を軽く除いてから、水溶性封入剤VectaMount AQ (VECTOR)、 ・遮光して乾燥後観察

  • 免疫組織染色

     医学部大学院生ですが、免疫組織染色で悩んでいます。 やり方は色々書いているのですがさっぱり・・・です。まず、還流固定で取り出した臓器をどのように保存しておくのが良いでしょうか?凍結保存ですか?それともパラフィン固定でしょうか?パラフィン固定するその前に4%?10%? パラホルムアルデヒドで保存?免疫組織染色する前に長期間保存しておくにはどのような方法が良いでしょうか?

  • FACS用の抗体を免疫染色に使えませんか?

    免疫染色をしている学生です。 論文に書いてあるクローンとおなじクローンで蛍光をラベルされたFCM用抗体が研究室にあります。能書にはFCM用onlyと書いてあるのですが、おなじクローンで免疫染色用の抗体が市販されているようです。FCMで使っている抗体を免疫染色で使えませんか?高価な抗体を買わなくても済むかもしれないと思い、質問させていただきました。使える場合、又は使用した経験のある方、希釈倍率はFCMと比較してどのように考えればよいでしょうか?ご教授お願いいたします。

  • 免疫組織化学について

    初歩的な質問ですが、おねがいします。 免疫組織化学を行うことになったのですが、抗体について質問させてください。 マウスの切片をABC法により染色しようと思うのですが、一次抗体にマウスで作成した抗体を用いることはできるでしょうか? 二次抗体で抗マウスIgG抗体を使用した場合、内在性のマウスIgGを認識してノンスペが出そうですが、当研究室には目的のタンパクを見る抗体がマウスで作成したものしかなく、値段的に新しい別の抗体を買うのは厳しいようなのです。 二次抗体のみを使用したネガコンと比べて比較等可能でしょうか。 よろしくお願いします。

  • 免疫染色の方法について(モノクローナル抗体の場合?)

    マウスを用いて免疫系関連の研究をしている修士2年です。研究室3年目にして恥ずかしいのですが質問です。 現在、ある内分泌器官を、DABを用いた酵素抗体法(ABC法)で染めて、あるペプチドを産生している細胞の頻度及び分布を調べようと思っています。用意した物とプロトコルは以下です。 ・組織サンプル(ブアン固定→パラフィン包埋→4μm切片) ・Elite ABC kit(内容:Blocking用Goat血清、biotin結合2次抗体、ABC溶液) ・1次抗体(Rabbit anti-(そのペプチド)antibody) プロトコル・・・通常の脱パラ、浸水化、抗原賦活化(一応)、内因性ペロキシダーゼ除去→kitのプロトコル(1次抗体は4℃o/n) この1次抗体は、ある先生に紹介されて知り合った他大のA教授に分与していただいたものです。A教授とは直接お会いしたことはなく、メールや参考文献も自分の指導教官であるB教授を通して受け取っています。A教授はこの1次抗体を自分で作成(既知のアミノ酸配列からペプチドを合成→ウサギに投与→血清から精製)して、その抗体を用いた染色で論文を沢山出しているような方です。その論文を参考にして、今回のプロトコルを組んで染色してみたのですが、全然うまくいきません。組織内の細胞がところどころポツポツ染まるはずなのに、赤血球と血管内皮細胞以外の組織細胞全部がベッタリと染まってしまうのです。A教授の染色で私の染色と異なる点は、動物がラットであること(問題のペプチドは両種で保存されていることが分かっている)、kitを使っていないこと(ABC法ではなくPAP法、発色は同じくDAB)のみです。 こんなことはA教授に聞けばいいのですが、うちのB教授は少々プライドが高いところがあって難しそうなのです。それに、B教授はもともと免疫染色が得意ではないようです。B教授は今のベッタリ染色像が正しい染色像だと思っていて、このまま私の論文まで持っていくつもりみたいですが、色々な参考文献を見ている私としては、このベッタリ具合は絶対何かおかしいのです。(でもB教授は私の意見はお構いなしです(ノд・。) )だって本当は、下垂体のACTH細胞くらいくっきり染め分けることが出来る抗体なんです。先入観を差し引いても、ラットとマウスでこんなに違うとは到底思えません。 さて、長々と読んでいただいてありがとうございます。。。質問は以下です。 1.私の染色方法やkitで、「もしかしてここのミスかも・・・」と気になる点があったら教えてください。(モノクローナル抗体を使った染色にはもともと不慣れです。) 2.指導教官であるB教授に「待った!」をかけるために、いい策はないでしょうか???(この質問に関してはカテ違いかもしれませんが・・・。)

  • 蛍光抗体法でホルマリン固定の組織を見ることは可能か?

    一般的に蛍光抗体法で観察できる組織というのは凍結切片だと思いますが、抗原賦活化を行ったホルマリン固定のパラフィン切片で観察することは可能でしょうか?免疫染色・イメージングのコツという本にはホルマリン固定だと、バックグラウンドが出やすいが蛍光抗体法で観察することができないことはなさそうに書いていたので質問させていただきました。

  • 免疫染色について(抗体)

    免疫染色に用いる抗体において同じ物質に用いるものでも、エピトープがC末端のものとN末端のものがありますが、どのように使い分ければいいのでしょうか?ペプチドの合成系を見たいのであればC末端のものを使用すればいいのでしょうか?抗体作成をしたりするラボではないため、そもそもポリクロでこのような違いがあることが充分に理解できておりません。初歩的なことかもしれませんがどなたか教えてください。