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電気泳動してもバンドが流れません。
PCRで増幅したものをアガロースゲルで電気泳動しても、ウェルの中から動きません。染色すると、ウェルの中で光っているのは見えるので、増幅はできているような気がします。 電気泳動の溶液が良くないのかと思い、E-gelでやってみたのですが、流れません。 DNAの状態がよくないのかと思い、同じDNAを用い、他のプライマーで増幅させたら増幅します。 プライマーがコンタミしているのかと思い、2社から新品で購入したのですが流れませんでした。 PCRにかけるときには、水とプライマーとDNAを入れています。水も毎回変えているので、正直原因がわかりません。 ちなみに、2回同じ条件で増幅できましたが、再現性がありません。 同じような経験もしくはアドバイス等ありましたら、お願いします。
- s322
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- de_tteiu
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一つずつ可能性を消していった方がいいでしょう 昨年度全く同じ実験で増幅できていたと言っても、今回はできていないのですから、まずはPCRで増幅されているか確認してください またアプライした量が適切かどうかも見てください もしPCR産物が出来ていたとしたら、巨大なPCR産物が出来ている可能性が高いので、 アニーリング温度を変える(2stepの場合は3stepにする) 酵素を変える プライマーを変える などしてください
- de_tteiu
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なるほど、そうでしたらおそらくtemplate同士がアニーリングするなどして巨大なPCR産物が出来てしまい、泳動できなかったというケースでしょう ところで >染色すると、ウェルの中で光っているのは見えるので、増幅はできているような気がします 吸光度を測るなどして増幅の確認はしなかったのですか?
補足
昨年度全く同じ実験で増幅できていたため、吸光度での測定による確認は行っていません。 巨大なPCR産物ができないようにするには、アニーリング温度を変えれば良いということでしょうか?
- de_tteiu
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質問の内容は ・目的のものと思われるPCR産物が泳動で確認できない ・そもそも泳動がうまくいかない のどちらでしょうか?
補足
他の部位のプライマーを用いた場合、PCR産物は通常どおりに泳動できます。 また、ラダー(マーカー)は上手くながれているので、PCR産物のみが泳動できていない状況です。 かなり昔から実験されているもので、文献を参考にサーマルサイクラーも色々な条件でやっていますが、同じ現象が起きてしまいます。
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