- 締切済み
ボイルプレップ産物をトランスフォーメーションに
ある構築済みのベクターをコンピを使って増幅しようと思っていたのですが、そのベクターが残りほんのわずかです。 一度形質転換を失敗したら失われてしまうぐらいしかありません。 しかし手元には、前回そのベクターを形質転換した際に確認のためとボイルプレップ法で精製したプラスミド産物があります。 万が一手元のコンストラクトを失ってしまうのを回避するため、ボイル法で精製したプラスミドを使って形質転換しようと思ったのですが、可能なのでしょうか？ コンピの菌株はDH5αを使用しています。 同様の実験を行った方おりましたら、注意点等があればご指南ください。
- みんなの回答 （2）
- 専門家の回答
関連するQ&A
- 遺伝子操作について教えてください
DH5αとM15の違いは何ですか？ タンパク質を発現させる操作で、pQEベクターにライゲーション後DH5αに形質転換し、プラスミドを抽出してM15に形質転換したのですが、どうして最初からM15に形質転換させないのでしょうか？ より効率よく発現させることができるのでしょうか？ 教えてください、よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 科学
- ベクターとプラスミドと形質転換
ベクターとプラスミドって何が違うんですか？ 意味的にはほとんど同じだと思うんですが。 形質転換で大腸菌に入れて増やしますが形質転換の時に導入した物と同じものが得られるんですよね？ 形質転換によってプラスミドはどれくらい増えるものなのですか？
- ベストアンサー
- 生物学
- 形質転換、形質移入、形質導入について
形質転換、形質移入、形質導入、という言葉の違いが分からなくなりました。形質導入はtransductionでファージを介しして菌にDNAを導入することで、形質移入はtransfectionで細胞にエレクトロポレーション法などで工学的に導入することで、形質転換はDNAが導入されて形質が変わる事を指すので、細胞、菌、両者とも形質転換した、と言えるのですよね？形質転換、形質導入の違いは、DNAを導入する際のベクターがプラスミドかファージの違い、とある本もあってますますこんがらがりました。ベクターの違いなのか、導入される物（菌か細胞（cos7など）で分けてるのか、また現象をさしているのか操作をさしているのか曖昧です。どなたか教えて下さい。
- ベストアンサー
- 生物学
- 組換えプラスミドベクターを制限酵素処理する実験から得られることは
実験から自分で判断しなければいけない問題があるのですがよく理解できないのでわかりやすく教えてもらえると助かります。 実験の概要は以下です。 まず、PCR法でE coli LE392の16srRNA部分をターゲットとして増幅させます。その後、(A)プラスミドベクターpBluescriptIIKS(-)と(B)PCR法で増幅させたE coli LE392の16srRNA部分を制限酵素XhoIで処理します。 その後プラスミドベクターpBluescriptIIKS(-)（制限酵素処理済）とE coli LE392の16srRNA部分（制限酵素処理済）を混合させ、ライゲーション反応を起こさせ、プラスミドベクターとPCR増幅部分を結合させます。その後、この混合液をコンピテントセルに挿入し形質転換させます。 ここまでで組換え体を作っています。 その後、コンピテントセルからプラスミドを抽出します。 最終的に生成された組換えプラスミドDNA溶液を(1)XhoIと(2)EcoRIの制限酵素で処理したものをつくりアガロースゲル電気泳動で泳動後、バンドの位置を確認するというものです。 ここで、問題が出てくるのですが、組換えプラスミドをXhoIとEcoRIで制限酵素処理しますがベクターpBluescriptIIKS(-)に対しPCR産物がどういう向き（センス、アンチセンス）で入っているのかを調べないといけません。 どのように考えたらいいのか教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
- 非環状プラスミドを取り込んだ大腸菌は生育しますか？
あるプラスミドベクターを、制限酵素で切断しました。 それを大腸菌コンピに形質転換し、LB＋アンピシリン培地上に塗布したところ、コロニーが形成されました。 知人曰く、『環状でないプラスミドを取り込んだ大腸菌は生育しない』だそうですが、理由がいまひとつ解かりません。 切断部位がアンピシリン耐性遺伝子でないし、複製起点も潰れていないので、コロニーが生えてても特に疑問もないのですが…。 知識不足で恥ずかしい限りですが、御回答頂けたら幸いです。宜しくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- プラスミドＤＮＡのい精製がうまくいきません・・・なぜ？
形質転換をしてアンピシリン耐性の大腸菌から、プラスミドＤＮＡをアルカリーＳＤＳ法により分離した所、精製したプラスミドＤＮＡをアガロース電気泳動をしたら、バンドの蛍光がすごく薄く、少量のプラスミドＤＮＡしか分離できませんでした・・・溶液も確実に加えていったつもりだったんですが・・・プラスミドＤＮＡ分離がうまくいかない原因がよくわかりません・・・どういうミスでそうなってしまうのか原因として考えられる事があったら教えてください。お願いします。 今プラスミドＤＮＡを使う実験に興味がありいろいろしてるんですがうまくいかず・・自信喪失状態でして・・回答して頂いたら嬉しいです。お願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- プラスミドの自己複製能について
プラスミドをベクターとして、遺伝子の増幅を行いたいと思っていて、ひとつ疑問に思ったのですが、例えばセルフライゲーションを防ぐために2種類の制限酵素を用いて目的遺伝子をプラスミドに形質導入した場合、元のプラスミドは不完全になると思うのですが、これでも自己複製能は維持することができるのでしょうか？ 理解が不十分なので、もし自己複製能を維持できるなら、なぜプラスミドの自己複製能が維持できるのかについても教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
形質転換には少量でいいとは聞いていましたが、具体的にそこまでの状態でも可能だとはついぞ知りませんでした。 コンピテンシーは悪くないものを使っているので、希釈・ボイプレ産物利用、2つの方法でトラフォメを進めて見ます。 ありがとうございました。