昆虫の切片作成について

質問

成虫したハエを使用して、切片を作成しようとしています。ハエ一匹丸ごと包埋し、切片にし、ヘマトキシレン染色をしたいと思っています。しかし、昆虫はクチクラ層を持っており、固定液を浸透させません。ミクロトームで、切っていると腹部の空気袋などには、パラフィンなどが染み込まず、うまくいきません。どのようにすれば、切片が作成できるのでしょうか。パラフィン包埋法を用いなくても良いです。

回答No.3

SaySei · ベストアンサー

つくっているのは植物切片なので、勝手が少々異なる可能性がありますが参考までに。

No.1の方のやり方を私のところでは「脱気」といっています。（固定のときだけでなく、樹脂切片の場合などは脱水の際も不安であれば行うことがあるので。）
サンプル管などの適当な入れ物に、試料（この場合はハエ）と固定液を入れてふた（ふたには穴をあけておく。突沸に似た現象が起こることがあり、その際に試料が飛び出るのを防ぐため）をして減圧し、試料中の空気を抜きます。
観察したい場所が分かっている場合は、極力切り出してから脱気を行うこともあります。
今回は「空気袋」にたまった空気をどうにかしたいということなので、減圧だけで問題なくいけるのはないかと思われます。（気管が通っているでしょうし、特に細胞を傷つけなくてもちゃんと空気が抜けると思います。）

in situハイブリダイゼーションも考慮するなら、パラフィンの方が良いでしょうから、樹脂については割愛します。

in situハイブリダイゼーションは経験がないので略。ただ、切片が作れる程度の実験室レベルだと厳しい印象があります。in situハイブリダイゼーションが可能なレベルかどうか、プロトコルを確認してみることをオススメします。
また、観察したいもの・方法によっても固定液を変えたほうが良いので、その点も注意して確認してください。

お礼

ご回答ありがとうございます。火曜日に早速試してみます。

回答No.2

suiran2

減圧固定とは、固定液に入れた資料を真空デシケーターに入れ真空ポンプで減圧するものです。組織中の気体が放出され完全に組織内に固定液を浸透させる方法です。一度固定液を浸透させますと、後は普通の操作で液が置換されていきます。機器がないのならボスに相談してください。

in situ　ハイブリダイゼーションは最近の研究法ですから経験できるはずがありません。固定液はホルマリンなのではないですか。その辺もボスに相談してください。

お礼

度々ありがとうございました。固定液はエタノールです。真空デシケーター等実験室にあったので、試してみます。

回答No.1

suiran2

何しろ何十年も前のことでほとんど忘却ですが、昆虫や内部に気体があるものは、減圧固定します。昆虫の成虫の場合には、アルコール・ブアン液の減圧固定で固定できたはずです。真空ポンプがないのでしょうか。なければアスピレーターでやってみて下さい。アスピレーターでやったことはありませんが、昆虫から泡が出れば浸透していることになりますから…

補足

丁寧に、ご回答ありがとうございました。減圧固定との事ですが、注射器の中に昆虫をいれて、減圧したのでしょうか。また、組織はボロボロにならないでしょうか。上手くいけば、切片作成後、in situ　ハイブリダイゼーションにもっていきたいのですが。宜しくお願い致します。