ＳＤＳサンプルバッファーを使ってのタンパクサンプルの作成

質問

ミオシンタンパクを抽出して、タンパク濃度を測定し、SDSサンプルバッファーで希釈する時のその方法ですが、ウェルに１０マイクログラムのタンパクが入るように計算して、それぞれのサンプルにあった希釈度を決定してサンプルバッファーを入れて作る方法と、（ＳＤＳの濃度が各サンプルごとで変わるからダメかな？）ある一定の希釈に決めて、ウェルに投入するときに１０マイクログラムになるように、投入量を5マイクロリットルとか8マイクロとかにするのとどちらの方がいいとか、決まった方法はあるのでしょうか。よろしくお願いします。

回答No.4

geneticist12 · ベストアンサー

>タンパク抽出液の濃度を合わせるのは、同じサンプルバッファーで調整したらいいのですか？それと、濃縮するとすれば、どうすればいいのですか？

現にタンパク質サンプルが懸濁されているバッファー（抽出バッファー）で希釈するのが基本でしょう。SDS-PAGEに使うだけなら、イオン強度やpHを極端に変えないバッファーであれば他のものでもかまわないと思いますが、わざわざそうする理由もないでしょう。

濃縮は、遠心限外ろ過（ミリポア/アミコン、ザルトリウスなどの製品あり）がよく使われます。ポアサイズによっては低分子量のフラクションが失われる可能性があります。
アセトンなどでタンパク質を沈殿として回収して再懸濁する方法もあります。
原理的にロスが全くないのが、真空乾燥、減圧遠心機で濃縮する方法です。塩なども濃縮されるので、イオン強度が変わってしまいますが、SDS-PAGEに使うならほとんど影響はないと思います。

回答No.3

otx

どうも質問者様がおっしゃるサンプルバッファーというのが
私が認識している、２×SDSサンプルバッファーとホモジナイズバッファー（タンパク質抽出液）のどちらを指しているのかがよくわからないので話が通じていない気がします。それで確認です。

通常、動物の組織などからタンパク質を抽出する場合、NP-40など弱い界面活性剤の入った生理食塩水（TBSなど）のようなホモジナイズバッファーで一度ホモジナイズなどすると思います。

前の書き込みでは、これを私はタンパク質抽出液と書いています。
この液を何らかの方法でタンパク質の量を定量し、各サンプルでタンパク量を合わせるのためには、ホモジナイズバッファーを使用します。

そうやってタンパク量を一定にした各サンプルに、それそれのサンプルの量と同じ量の２×SDSサンプルバッファー（濃度が２倍のSDSサンプルバッファー）を等量加えるのです。

そうすると、最終的に同じタンパク量、同じ１×SDSサンプルバッファーの濃度となって泳動することができます。

私が何も考えないでするときの方法です。
至って普通の方法の１つであると思いますが・・・。
もし、質問者様の周りに相談できる人がいるのであれば、ネットでなく直接指導を乞う方がいいと思います。

参考までに。

回答No.2

otx

特に、決まった方法はありません。
質問者様が、どうしたいのか、それを実行するのにどうやったら正確か？
どうなったら他の人に信用してもらえるか？
などをを考えて最良と思われればいいと思います、常識の範囲内で。

ちなみに、私は
各サンプルのタンパク抽出液の濃度を合わせる。
↓
各サンプルの液量と等量の２×SDSサンプルバッファーを入れる。
↓
各サンプルを等量、泳動する。

といういうふうにやっています。簡単なほうがいいですから。
参考までに。

補足

ありがとうございます。基本的なことですが、タンパク抽出液の濃度を合わせるのは、同じサンプルバッファーで調整したらいいのですか？

回答No.1

geneticist12

まず、すべてのタンパク質抽出液を同じ濃度に調製しておきます。一番薄いサンプルにそろえるか、場合によっては濃縮して調製し直します。
泳動サンプルは、各サンプルから等体積ずつ取ります。
なぜそうした方がいいかは、
・サンプルごとに取る量が違うと途中でピペットの目盛りを変えるので手間も増え、間違いや誤差の危険が高くなる。誤差はたとえば、マイクロピペットの2 uLと4 uLが正確に二倍とは限らない（ピペットの仕様上、扱う体積によって誤差率が違う）ことで生じる。
・ピペットで扱う量が少量ほど誤差やバラツキが大きくなる。
・もとのタンパク質サンプルの濃度を調整する方が扱う体積が大きいので正確に扱いやすい。
・繰り返し実験をするときにもサンプルごとにいちいち測らなくて良いし再現性も高い。

補足

ありがとうございます。otxにも同じ質問をしていますが、基本的なことですが、タンパク抽出液の濃度を合わせるのは、同じサンプルバッファーで調整したらいいのですか？それと、濃縮するとすれば、どうすればいいのですか？