- ベストアンサー
HPLCのプレカラム法のやり方
ある物質の検出を頼まれたのですが、UV吸収も蛍光もなく、 (MSは機器がないため検討もできません) 文献上の緒言ではニトロ基のある試薬を反応させ (nitro~と書かれていた気が・・・) プレカラム法で蛍光検出ができると書かれていました。 (文献は請求中なので詳しいやり方が今のところわかりません) 今まで1回もプレカラム法でやったことがないため プレカラム法がどのように行うのか、どの程度器具や手間ひまがかかるのか皆目検討もつきません。 そこで質問なのですが、プレカラム法というのは手間ひまが どれ程かかるものなのでしょうか? (種類や方法によってピンキリなのでしょうが、回答者様が行ったことのある方法でよいので参考に教えてください) サンプルの除タンパク目的で有機溶媒を加えるみたいに、 サンプルに試薬を加えて数分待てばOKなどというような 簡単な方法も中にはありますかね・・・?
- hit999
- お礼率25% (76/295)
- 化学
- 回答数4
- ありがとう数4
- みんなの回答 (4)
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
数分待てばok…という超簡単なものはないかもしれませんが、生物屋さんでもやれる方法ならあります。 プレカラム法とは、検出対象に化学反応を掛け、検出可能な誘導体にしてからカラムにかけ検出する方法です。蛍光検出とありますが、特定の官能基と反応するような蛍光試薬が市販されています。その試薬の取扱説明に従えば、特定の官能基を介した蛍光ラベルが簡単に可能です。私がラベルしていた物質は、試薬を混ぜてインキュベート1時間で反応が終わってました。ラベルした後は普通のカラム(HPLC?GPC?)と同様です。 恐らくその論文にあるのは、「ある物質の特定の官能基」と反応して蛍光を発する試薬なのでしょう。が、蛍光を発する化合物なんてたくさんあるので、これだけでは手間についての詳細は分かりません。 プレカラム未経験者ということで、参考程度に聞いてください。
その他の回答 (3)
- caesart
- ベストアンサー率40% (10/25)
No3補足です。 一番簡単なのは移動相に反応試薬を混ぜて測定する方法です。 オキシテトラサイクリン等の測定に用いるイミダゾール、マグネシウム含有の移動相がこれに当たります。
- caesart
- ベストアンサー率40% (10/25)
プレカラム法の原理はNo2さんがおっしゃってるとおりです。 私が以前にしたことがあるのは、HPLCカラムの前に反応用のコイルをつけて試料の注入時に(インジェクションの後で)反応試薬を混ぜて流路(反応用コイル)に導き、反応条件の温度に設定した反応槽を通してそこでで反応させ、測定用カラムに導入する・・というものでした。 液クロの一部として反応槽がシステムに組み込まれている(場合によっては反応槽用の別ポンプで反応試薬が流れるようになっている)必要があります。 インジェクション→反応用コイル(及び反応槽)→カラム→検出器 という流れになります。
- elpkc
- ベストアンサー率53% (626/1160)
一般的には、プレカラムというのは、実際のカラムの手前につける 短い同じ充填剤のカラムのこと言いますが。 カラムが高価だった頃にカラムの傷むのは、入り口部分の主なので、 分離が悪くなれば、そのプレカラムだけを交換するということをするためのものです。
お礼
すみませんでした。 英語をそのまま書いてしまいました。 正しくは蛍光検出の誘導体化のプレカラム法です。
関連するQ&A
- HPLCの溶媒ピーク
HPLCの溶媒ピークについて質問です。現在、あるサンプルをUV検出器を利用してHPLC分析おこなってます。移動層はアセトニトリルと水&0.1%リン酸のグラジエントです。サンプルはメタノールに溶解して10μLでインジェクトしてます。標準曲線のR2も0.95以上の値がでてます。 何が疑問なのかというと、メタノールのみでインジェクトした時(気になってやってみました。)、メタノール溶媒のピークが標準サンプルのピークとまったく同じ場所に同じようにでてしまうのです。ピークAreaは標準サンプルの0.01mg/mlと同じくらいの値です。これはどうしてでしょうか?シリンジをよく洗浄しても同じようにサンプルとほぼ同じ場所にピークが検出されます。原因がよくわかりません。 ご教授お願い致します。
- ベストアンサー
- 化学
- HPLCでサンプル(複数)を分析するにあたって。
HPLCでサンプル(複数)を分析するにあたって、どういった手順で進めていけばよいでしょうか。どなたかご教授下さい。 手順の例) サンプルの分析時間、平衡化時間、グラジエント時間、カラムの洗浄方法の検討等 ちなみに、逆相系HPLCを使って以下の条件で食品中のペプチドを検出しようと考えています。 <HPLC条件(グラジエント溶出法)> 移動相A:0.1%トリフルオロ酢酸-蒸留水 移動相B:0.1%トリフルオロ酢酸-アセトニトリル 流速:1.0ml/min カラム温度:室温 検出器:UV(220nm)
- 締切済み
- 化学
- HPLCでの有機酸測定について
生体サンプル(盲腸および糞中)の有機酸の測定(特に乳酸およびコハク酸)をしたいと思っています。 図書館で調べたり、抽出方法などを考えて測定しているのですが、残念ながら知識がほとんどなかったりするので、測定結果も芳しくありません。 pubmedなどは探したのですが、イオン交換クロマトグラフィーでほとんど測定されています。 私は逆相クロマトグラフィーで東ソーのODS100というカラムを用いて測定しようと思っているのですが、なかなかうまくいきません。 測定条件・サンプル処理法についてアドバイスや参考となる文献を教えて頂きたいと思います。なお、下記に現在の測定条件を書いておきます。知識のなさ故に、全く見当違いの方法でやっているかと思います。 優しく突っ込んで頂けると助かります(>_<) 現在の測定条件:移動相-0.1 %リン酸 , 検出波長-210nM サンプル処理法: 1 サンプルを純水にて抽出して遠心分離 2 上清に1N過塩素酸 200μL入れて蓋をして加熱し、タンパク除去 3 ふたを外して加熱し、揮発性物質の蒸発させ、遠心分離 4 上清にクロロホルムを入れて脱脂質し、遠心分離し、クロロホルムを除去 5 上清ヘキサンを入れ、さらに脱脂質し遠心分離 6-1 上清をHPLCに注入(感度が低いながら、分析可能) 感度を上げるため、濃縮乾固を行いたいので、実際は 6-2 上清に0.2N NaOH/MeOH 1mLで塩化して濃縮乾固 7 純水で溶解してHPLCで注入(これだと、うまく分離できずピークが検出できない) というやり方です。 細かい事でも良いので、突っ込みor参考図書・文献があれば、宜しくお願いします。
- 締切済み
- 農学
- 分光光度計(UV)とHPLC-UV法の感度の違い
分光光度計(UV)はHPLC-UV法よりも感度が低いのかどうか教えてください。 例えば、ある物質Aの未知濃度(約5~100μg/mL水溶液)のサンプルの濃度を定量したいのですが、物質Aの100μg/mL水溶液の吸光度を分光光度計(UV極大230nm)で測定したところ、0.1となり、吸光度が低い結果となりました。 一方、HPLC-UV法(50μL注入)で物質Aの100μg/mL水溶液を分析した結果、面積値は700000であり、物質Aの5μg/mL水溶液の面積値は35000でしたので、定量ができそうに思います。 この場合、分光光度計(UV)での定量は難しく、HPLC-UV法で定量するのが良い、と考えられるのでしょうか。 なお、分析の誤差は0.5%以内にしたく、物質Aは単一物質であり、カラムで分離する必要はありません。 分光光度計(UV)もHPLC-UV法も同じUV検出機器であるのに、HPLC法の方が感度が高い、ということがよく理解できません。 どなたかこの理由を教えていただけないでしょうか。よろしくお願い致します。
- 締切済み
- 化学
- 薄層クロマトグラフィー法によるo,p-ニトロアニリンの区別
先日、大学で実験したのですが、粗製と精製のp-ニトロアニリンを薄層クロマトグラフィー法で移動距離の差によってo-ニトロアニリンを検出しました。溶媒は1,2-ジクロロエタンでした。p-に対してo-は移動距離が大きいのですが、なぜでしょうか。溶解度の差なのか、配向性の問題なのか、極性の問題なのか、よくわかりません。配向性と極性は関連があるというような話を聞いたことがあるような気がするのですが、どうなのでしょうか。また、アセトアニリドのニトロ化の際にp-ニトロアニリンができやすいのはp配向性が関係しているのでしょうか。ご教授よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 化学
お礼
ありがとうございました。 1~5時間、インキュベートをかけるとかかれている試薬がありました。1分待てばOKというのも見かけたので、もう少し詳しく調べてみたいと思います。