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遠心分離の条件について
現在数種の真菌（酵母）を培養し、遠心で回収している、大学生です。 先輩のプロトコルをみて300mlくらい入る遠沈管で全容積200ml、8000rpm、20min、4℃で分離を行ったところ、S.cerevisiaeでは上手く沈殿が出来たのですがSchizosaccharomyces pombeでは、ゆるくて駄目な沈殿しか出来ませんでした。 その後容積を半分くらいに減らし、5000rpm5～10min4℃で行った時には適切な沈殿が出来ました。こんなことが2回ほどありました。 回転数も時間も減らしてペレットが出来たという事を他の人にもしましたが、反応はいまいちです。そして自分も疑ってます。 実際にこういったこともあるのでしょうか。個人的には遠沈管内での液層の対流を疑ってます。 どうか回答お願いします。ついでにfungiの培養における温度の影響についてもアドバイスお願いします。JCMで調べた培養条件よりも5～10度ほど高い温度で培養中ですが、どうも増え方が悪いです。アドバイスあればお願いします。
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あまり難しく考えなくてもいいのではないでしょうか？ ＞回転数も時間も減らしてペレットが出来たという事を他の人にもしましたが、反応はいまいちです。そして自分も疑ってます。 実際に、ペレットができてるのですから、それが真実でしょう？反応がいまいちな他の人に直接見せれば「あぁホントだ」の一言で終わることですよ。 個人的には理論ではなく経験的にですが、容量を半分にしたからうまくいったのではと思うのですが。別にしなくてもいいですが、容量を半分にして8000rpm、20min、4℃でやってみるとわかることです。 そもそも確かめることに意味を感じませんが・・・。 遠心して菌を集まればいいわけじゃないのでしょうか？わたしだったら学生に「まぁ深く考えないで、この作業は菌が死なずに集められればいいのだから。他に勉強したり気をつけなくてはいけないことはあるしね」って言うところです。 質問者様の突き詰めを止めはしませんが、感想です。 ＞JCMで調べた培養条件よりも5～10度ほど高い温度で培養中ですが、どうも増え方が悪いです。アドバイスあればお願いします。 うまくいっている間は（何をもってうまくいっているというのは難しく、研究者はあまり条件を変えたがらないと思いますが）、ちょといじってもいい時もあると思いますが、明らかにうまくいっていないというのならば、条件を戻すべきです。 培養条件が ＞ちなみに本培養(坂口フラスコ)は冷却が出来、25℃で培養したところ、それなりに良い結果です。アドバイスあればお願いします。 アドバイスも何も結果は明らか、25℃になるように環境を研究室で考えましょう。これのみです。 人間、考える労力はある程度決まっていると思うので、その配分を考えましょう。 こだわらなければいけないところはこだわる。 こだわらなくてもいいところはこだわらない。 これを見極めるようになるのも実験をするときには重要だと思います。
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- MIYD
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遠心機がスイング型でもアングル型でも、 内側はgがあまり大きくないので、それが影響しているのかもしれません。 別に何度でも追試が出来る操作ですので、 繰り返し行い、再現性が見られるのでしたら、ラボのみんなに紹介してあげましょう。 遠心機の混雑がいくらか減ります。 >その後容積を半分くらいに減らし... 前述の遠心をした後のサンプルをその後さらに遠心したという意味であれば、 ゆるいペレットが硬くなったのかもしれません。 >JCMで調べた培養条件よりも5～10度ほど高い温度で培養中ですが なぜ高い温度で培養しても増殖すると考えているのですか？ >アドバイスあればお願いします。 推奨条件に戻してはいかがでしょうか。
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お礼
回答ありがとうございます。研究室に所属したばかりの不勉強で、質問も分かりづらい中での回答助かります。研究室自体にもノウハウがなく、また論文や文献を探す力が無い若輩者にも応えてくれてありがいたいです。 今後も回答いただければ幸いです。
補足
不勉強で申し訳ないです。お礼と合わせて当方の状況の説明を致します。また回答いただけたら幸いです。 １）遠心について 不勉強です。スイング型というのは遠心力の方向にサンプルの容器が稼動する方法、アングル型はサンプルの角度が固定ということで良いでしょうか。それでしたら現在問題としているのはアングル型の方です。 「内側のgが少ない」についてもう少し詳しく説明していただければ幸いです。 ２）遠心の容量に関して 正しくは遠心後にそーっとデカンテーションしようとして半分まで捨てた所で断念したというのが実際です。その後手振りで懸濁後条件を低くして遠心しました。 ちなみに私のラボでは複数菌種を培養しているのは今のところ私だけですが、回答者様のアドバイスの通り、そのデータを残す必要は在ると思います。 ３）培養の推奨条件について 現在前培養（L-tube）に使用中の恒温機に冷却機能がなく、設置環境のせいか推奨環境の25度よりも高い30～35℃よりもさがらないのです。ちなみに本培養(坂口フラスコ)は冷却が出来、25℃で培養したところ、それなりに良い結果です。アドバイスあればお願いします。