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アルブミンを使った検量線（Bradford法）
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- -cococo-
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- 生物学
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質問者が選んだベストアンサー
BIO-RADのプロテインアッセイ（？）を使ってるにしては組成が変だし、そういうやり方でANo.3の方の言うような式が出るとは思えません。試薬の使い方を確認してみてはどうでしょうか。 それから、ANo.1の方も書いておられますがXとYに吸光度とタンパク質濃度のどちらを当てはめたのかはあなたしかわかりません。XYのどちらが吸光度なのかはご自分で確かめて下さい。 βガラクトシダーゼ活性を吸光度で測ったということなら、おそらくサンプルの液量あたりの活性(unit/ml)がわかるんじゃないですか？ Bradford法でタンパク量(mg/ml)がわかったなら、あとはこの二つの値からunit/mgを計算するだけです。
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- guragura77
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酵母をすり潰して抽出液でβガラクトシダーゼ活性を測っているのかと思っていたんですが、 ＞βgal吸光度/（タンパク吸光度*サンプル量*反応時間） こんな計算でunitがわかるとは思えません。光路長とかモル吸光係数とか計算に出てきませんか？ そういう数値があって、さらに「タンパク吸光度」じゃなく「タンパク濃度」であればunit/mgを求めるという目的に適う式になりそうなんですが。この「タンパク吸光度」が何を指しているのかよくわからないので的外れな事を書いているかもしれません。 βガラクトシダーゼ活性の測定に抽出液ではなく酵母培養液を使っていて、式の「タンパク吸光度」が「濁度」であれば出てくる値はOD600が1の酵母培養液1mlあたりのunit、になるような気がします。 生物分野の計算なんて大して難しい事はしないので、計算の意味を考えてみてはいかがでしょうか。
お礼
アドバイスありがとうございます。 計算の方法をもう一度練り直してみて 無事解決することができました。 ありがとうございました。
- stripe-k
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Bradford法では、BSAは、0.2～1.0mg/mLの範囲で検量線が引けます。市販の試薬ですと y(TP)=0.996x(A595)-0.652 R^2=0.999 程度になるはずです。
お礼
具体的な数字を出して頂きありがとうございます。 この式を参考に、もう一度やり直すか グラフを作り直してみようと思います。 ありがとうございました。
- keiii1i
- ベストアンサー率47% (30/63)
すいません 間違いです Bradford法で総タンパク量を求めるんですね なので、得られたｍｇ/ｍｌは総タンパク量です でもunit/ｍｇは酵素活性の実験しないと求めれません タンパク質1ｍｇ中の酵素量の指標です 酵素もタンパク質ですので。
お礼
丁寧な御回答、ありがとうございます。 言葉足らずだったのですが、自分のサンプルのほうは 酵母のTwo-hybrid法を用いてβガラクトシダーゼアッセイ を行ってスクリーニングして得た未知のタンパクです。 タンパクとβガラクトシダーゼ活性の吸光度をそれぞれ測って βガラクトシダーゼの相対比活性を算出しました。 unit/mg proteinの単位で出すように言われているので この場合、βガラクトシダーゼ活性を測ったほうの吸光度を ｙに入れて計算すれば良いのでしょうか？
- keiii1i
- ベストアンサー率47% (30/63)
ｙ軸に吸光度 ｘ軸に濃度を取ったのならｙに吸光度いれればアルブミンのｍｇ/mlが得られます。サンプルにアルブミンだけが含まれる場合だけ・・・ Ｕ/mgは酵素の比活性の単位じゃないですか？ 血清アルブミンは臨床的にはｍｇ/ｄＬです
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