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エレクトロポレーション
エレクトロポレーション素人です。 動物細胞のプライマリーカルチャーに エレクトロポレーションで遺伝子導入しようとしていますが全然入りません。 条件検討をしようと思っていますが、何をどうすればいいのでしょうか？ voltageを変えるのはなんとなくわかりますが、capacitor=capacitance、 resistor等の条件はどうすればいいのでしょうか？ どうゆう条件設定をすればよいか教えてください。 →まずどれを振って、それから、、、、など。 ちなみに使っているDNAはHelaでちゃんとしていることは 確認済みです。 使用している機種は、 EasyjecT Optima (Equibio)です。 よろしくお願いいたします。
- betajini
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- D-edge
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標準条件がそれなら、そのあたりから探せばいいと思います。 細胞にも個人差がありますから。 電圧を300vに固定して、電気容量を1000～3000μFに設定して生存率と細胞数のグラフを書きます。 細胞が半分くらいになって、そこそこの生存率を示すところが導入効率が一番良いところなので、その辺が見つかったら、今度はその電気容量で電圧を微調整。 そうしていけば、一番導入しやすい条件が見つかると思います。 補足遅れすぎですみません。
説明書に代表的細胞のエレポ条件が、おそらくは書いてあります。そこになかったとしても、ネット上に各細胞ごとの奨励条件が説明されたホームページがあります。バイオラッドではそうなのですが、 Equibio社の者を使っていらっしゃるのですね。うーん、でも、製品だけ作って販売し、標準条件を説明しないことは、まず考えられないので、説明書やネットを探してみてください。 あと、プライマリー細胞には、一般的には遺伝子導入しにくいですよ。それをあらかじめわかったうえでも、まだ効率が低いと感じますか？もしそうであれば、他の手段を用いる方法もあります。キアゲンのEFFECTENEなど、操作も簡単・安価・効率もいいといういい製品があります。エレポにこだわらないでもいいのなら、そのような方法もあります。 具体的に、どのな細胞にどういうパルス条件を使っていますか？あと、導入の効率は何でモニタしていますか？そのへんも記載していただけると、答えやすいかと思います。
- D-edge
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付属の資料に動物細胞のおよその値はかいてあるはずで、その中から探せばいいはずですが・・・。
お礼
ありがとうございます。 標準条件は、280ｖ、1500μFで 4mmキュベットとなっていますが これでは全然入りません。
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お礼
ご回答ありがとうございます。 細胞はグリア細胞です。 パルス条件は、280ｖ、1500μFで 4mmキュベットです。 導入効率は、CMV-GFPとCMV-lacZを cotransfectionし、蛍光とX-gal染色 で見ています。