アガロースゲル電気泳動

質問

PCR法で処理したDNAをアガロースゲル電気泳動をしました。

　レーン１　DNA分子量マーカー（１Kｂｐ）
　レーン２～レーン４　PCR産物１
　レーン５　DNA分子量マーカー（１００ｂｐ）
　レーン６～レーン８　PCR産物２

　レーン１からレーン４はアプライする時にゲルにさしてしまいました。
　レーン５～レーン８はアプライは綺麗にはいりました。

　結果はレーン１からレーン４まではバンドが見えたが、レーン５はライトにあてるとやっとなんとか見える程度で、レーン６～レーン８は何も見えなかった。

　レーン６からレーン８はPCR産物２を入れ忘れたと考えられるが、レーン５の分子量マーカーがきちんとでなかった理由がわかりません。

　どのような理由が考えられるでしょうか？

　またアプライするときにゲルにさしてしまったことで、さしてない方に影響出たりはするんでしょうか？

回答No.6

MIYD

何を聞いているのかが伝わっていないのでしょうか。

>刺してしまったのは垂直にさし、ウェル内でした。

ウェル内にはゲルが無いので、
そこにチップが入っている状態は通常の状態です。
その状態ではゲルに傷はつきません。

逆に、ウェルの空間内にチップが入っていなくて、
ゲルの上面よりも上から注ぎ込んでいるのでしたら、
ウェル内に入らなかったり、他のウェルに入ってしまう可能性があります。

それとも、ウェルの底に傷を付けたということでしょうか。
通常DNAをローディングする際には、DNAが浮いてこないように、
グリセロールやフィコールなどが入ったローディングバッファーと混ぜて比重を重くしてローディングします。
(緩衝能がないものもありますが)

底に穴が開いていれば、そこから下に漏れていきます。

お礼

すみません、言い方が悪かったみたいですね。
刺したのはゲルに対してウェルを通り越しゲルに垂直に刺し、入れた物質はウェル内にはいってました。
もれてたことはないと思われます。

回答No.5

MIYD

そういえばPCR産物のサイズはどのくらいなのでしょうか。
1つのゲルで流しているようですし、
100bpラダーは私が使ったことがあるものでは1~1.2kb位が一番大きいサイズでしたが、
そのサイズを流しきってしまったために見えていないということはありませんか？

ウェルに刺したと言うのがいまだに理解できていないのですが、
ウェルの空間から泳動の方向に対してどの位置に刺したといっているのでしょうか。
また、刺して出来たゲルの穴にサンプルやラダーをアプライしたのでしょうか。
それとも、刺したけれどもサンプルはウェル内にアプライしたのでしょうか。

刺したところのみにサンプルをアプライしているのでしたら、
その1点からサンプルが流れますので、ウェルの幅のバンドではなくなりますし、
狭いところにたくさんのDNAを流すために泳動が乱れる場合があります。

隣のサンプルの泳動への影響ですが、
隣のウェルの底に穴をあけたり、塩濃度が大きく異なるサンプルを入れているのでなければ、
まず影響は無いと思います。

お礼

刺してしまったのは垂直にさし、ウェル内でした。
流しきったってことはないです。
ご丁寧に説明ありがとうございました。

回答No.4

Dr_Hyper

Fast Blast DNA Stainを使用しているのであれば、量が少なすぎての可能性が大きいですね。たしかこの染色は一晩付けても50ng以上ではないとちゃんとしたバンドとして検出できないのではないでしょうか。
もしDNA分子量マーカー（１００ｂｐ）が100bpの一本のバンドであれば、その濃度を。（もし
100bpラダーのことであれば、このマーカーは500ngを泳動すると一本のバンドはだいたい20-40ngで２本ほど（会社によって違うでしょうけど）は90-100ngでしょうから、もしラダーマーカだと言われれば、そのtotal量を聞いてみたら検討は付きますね。）

やっとうっすら見えたのは、このバンドが50-70ng程度？であとは検出限界以下かもしれません。学生実習であれば染色は一晩ではないでしょう？通常の実験ではエチブロを用いるヒトが多いので10-50ngぐらいを流すと見えるだろうと思っているのですが、この染色液は毒性が低いので学生相手には使用しやすいですが、そのぶん感度はやや落ちます。
ゲルをろ紙の上で引圧で乾燥させる（ゲルドライヤー）とバンドが浮き出てくる場合もありますが、もう遅いですね。。。。

お礼

お返事ありがとうございます。
私達の班は出なかったので、一晩おいたんですが、かわらなかったです。
エチブロって毒性が強いんですね。
勉強になります。
ありがとうございました。

回答No.3

MIYD

エチブロはゲルに入っていたのではないでしょうか。

kbラダーと比較して、100bpラダーは早く流れます。
先に流れた100bpラダーからエチブロが抜けて、
薄く見えている可能性はあると思います。

ゲルのどこに刺したのかによりますが、
ウェルの前後左右であれば、そこからDNAが絵移動されるために、余計なバンドやスポットが出てくる可能性があります。
底に刺したのであれば、DNA溶液が流れ出てバンドが検出されない可能性があります。

お礼

コメントありがとうございます。
先生に確認したところ、エチブロははいっていないということです。
エチブロのかわりにFast Blastを使用しました。

ウェルにさしたレーンはマーカーが点になってましたが出てました。
ウェルにさしていないやつが出ていなかったので、ウェルにさしてしまったことで、さしてない方に影響出たりするのかがわからないのですが、水平方向の電気泳動でしたので、ウェルにさしてもささなくても泳動距離が変わらないのではないかと考えたんですが、間違っていますでしょうか？

回答No.2

sachihappy777

No.1です。
エチブロをいれていないとのことですが、ゲルの染色は何を行っているのでしょう・・？
TAEバッファーとアガロースゲルだけではバンドが見えないですよ。
何か染色剤をいれていると思うのですが

お礼

染色剤は前ではなく後で入れるFast Blastを使いました。

回答No.1

sachihappy777

1kbpのマーカーと100bpのマーカーの濃度が異なるため同量入れても含まれるDNAの量に違いが出る。とかぱっと思いつきました。

また、UV照射時のゲルの向きでバンドの見え方（濃さ）が異なることがあります。

それからエチブロはゲル作製時に入れていますか？
この場合、ゲルを作ってから時間が経過すると見え方が悪くなったりひどいと全く見えなくなることがあります。

それとエチブロが均等に行き渡ってないとか・・

私が考えられるのは以上です。

私ならマーカーがおかしい場合はゲルを作り直して泳動しなおします。

お礼

すぐに返答ありがとうございます。
エチブロは使ってません。
試薬としてはTris-acetate-EDTAバッファーとアガロースを使いました。
学生実験のためやりたくてもやりなおせず、はっきりした理由がわかりませんでした。
またよろしければ、意見をいただけたら嬉しいです。