ウエスタンブロットのブロッキング

質問

ウエスタンブロットで膜のブロッキングをする際には
BSAやskim milkが一般的かと思いますが、いずれも成功しません。
他の質問ページで、ロシュのwestern blocking reagentがよいと
書いてあったので調べてみたところ、この主成分はカゼインでした。
おそらく、skim milkと同じような結果になるのではないかと思われます。
他にブロッキング剤として使える身近なものはないでしょうか？

回答No.3

MIYD

ちょっとやりたいことと違うかもしれませんが、
1% ゼラチンを使うプロトコルがあるようですね。
http://molpharm.aspetjournals.org/cgi/content/full/55/2/356
(のScreening of the Library.)

あと、下に書いたスキムミルクは飲料用です。
バックグラウンドが高いスキムミルクは飲んでしまうので無駄になりません。
比べたことはありませんが、
試薬のものよりも飲料用のほうがよくブロッキングできるという噂があります。

お礼

何度もありがとうございます。
検討してみます。

回答No.2

neuro

市販のブロッキング剤も基本的にはskim milkなどと同じですが、経験上、どちらかと言えば、ブロッキング剤によるエピトープのマスキングが起きないように最適化されているように思います。
　今回の件ですが、成功しないというのは非特異結合が消えないということでしょうか。それとも抗原がマスキングされてしまうということでしょうか。前者であれば、ブロッキング剤を変えることでの効果は薄いような気がします（あくまでも私個人的な経験上での判断ですので可能性はあるとは思いますが）。

　それよりも、私の場合、抗体の方が問題の場合もありました。血清よりもIgG精製、さらに抗原ペプチドによるアフィニティ精製済、できればモノクローナル抗体・・・というように最も条件の良いものを選んでみてはいかがでしょう。勿論、二次抗体を使用しているのであれば、そちらの信頼性も確認してみて下さい。最近はエンドユーザーに商品検査を兼ねて粗悪品を販売するケースもありますから・・・。

お礼

ありがとうございます。
おそらく、非特異的な結合のせいだと思っていたのですが、
抗体もあやしいかもしれません。
検討してみます。

回答No.1

MIYD

私はナカライのblocking oneを使っていますが、
身近なものですか。

スキムミルクはメーカーごとにバックグラウンドの出方が違うといわれていますが、
いろいろ試してみましたか？
うちでは今は森永の製品を使っています。

あと、抗体の希釈が濃いためにバックが出るということもありますが、
ブロッキングがうまくいっていないことが成功しない原因なのはどのようにして確認しているのでしょうか。

お礼

早速のご返答ありがとうございます。

メーカーごとに差があるのですか．．．。
私はwakoの製品を使用しています。
いろいろな種類を試すことができない環境下なので、
それはできませんが。
抗体の濃度はその製品が推奨している濃度しか試していないので、
検討する余地はありますね。

私がしている実験は、膜に或るタンパク質を転写しておき、
ブロッキングします。その後、膜をBSA溶液で浸し、
転写されたタンパク質がBSAと結合するかどうかをanti-BSA HRP抗体
で検出しています。anti-BSA HRP抗体を用いた検出なので、ブロッキングに
スキムミルクを使用しているという状況です。

ブロッキングがうまくいっていないという表現が正しくない
かもしれません。