PCRでの分子量の見極め

質問

RT-PCRを行っているのですが、プライマーが4種類になるのでアニリングを最も低い55℃で行いました。当然、非特異的バンドが出てくるのですが、どのバンドが目的のものか悩んでいます。
産物の分子量を求めれば同定できると思うのですが・・・。プライマーを購入する際にfowardもreverseもMWが書いていますが、PCRで出来上がった産物の分子量をそのMWから求めることは出来ないのでしょうか？
（もちろんアニリング温度を高めてシングルバンドを確認するのがいいのかもしれませんが・・・。）
基本的な質問で申し訳ありません。何方か教えてください。

回答No.3

taqz · ベストアンサー

こんばんは。
＃２で回答した者です。補足を受けて追記します。
同時にプライマーを加える必要がない場合は別々の条件で行うほうがいいと思います。また、プライマーごとにPCRのサイクル数を調節することも大切です。特に泳動したPCR産物のバンドの濃さで発現量を比較する場合は、サイクル数が増えすぎると増幅反応が飽和して、mRNAの発現に差があってもPCRの結果には(反応が飽和してしまって)同じ濃さになってしまったバンドが並ぶことになります。

お礼

ご返答ありがとうございます。
そうですか、飽和状態になってしまうことがあるのですね。考えが及びませんでした。
よく論文で“対象プライマー／ポジコンプライマー”で比を出してたくさんのサンプルを統計処理していますよね。あれをやろうと思っていました。そのためにはPCRも電気泳動も同じ条件で行う必要があると思っていました。飽和状態になるのだったらプライマーごとにベストなPCRをかけて、電気泳動のみを同じ条件というより同じゲルで泳動すれば良いのですね。
非常に参考になります。リトライしてみます（PCR産物は合計500ヶくらいになります（泣））。ありがとうございました。

回答No.2

taqz

こんにちは。
どのような理由で多種のプライマーを同時に加えているのか分からないので、アドバイスになるか分かりませんが、controlとしてそれぞれ１対のプライマーのみを加えたPCRをして、それをマーカーにするというのはどうでしょう？それぞれのプライマーの至適条件で特異的産物を増やしておいて、泳動のときに非特異的産物の多いサンプルの横で同時に流せば目的のバンドを見分けられるのではないでしょうか？

お礼

ご返答ありがとうございます。
ご提案のように、至適条件で増やしてストックを作っておくのは良い考えですね。非常に参考になります。早速やらせて頂きます。ありがとうございました。

追伸：質問が誤解を招くような表現で申し訳ありません。
PCRの際に一つのチューブ毎に使用するプライマーは一種類にしております。具体的には一つのテンプレートに対して、4つのプライマーをそれぞれ違う4本のチューブで反応させています。ですが、プライマーごとに業者の指定している温度が56度のものあれば67度くらいなものもあります。それぞれのチューブを同時にPCRをする条件としてその最低の56度をクリアーするようにアニリング温度を55度で行っておりました。そのため67度の設定のものは当然非特異的バンドが増えてしまって困っておりました。（普通はプライマーごとにアニリング温度を変えてされているのでしょうか？例えば私の場合は4回(？)すべきなのでしょうか？全くの素人ですみません）

回答No.1

desert

プライマーのMWは、PCR産物のMWとは全く無関係（相関なし）です。
プライマーを作られているということは、テンプレートの塩基配列はお分かりですよね。プライマーはテンプレートのどの部分に付くのかを見てください。プライマーの部分を含めて、PCRにより増幅される部分は何bpにあたるでしょうか？
PCR産物の電気泳動で、サイズの分かっているマーカーを隣のレーンに入れておけば、PCR産物のおおよそのサイズが分かりますので、目的のバンドがどれか分かります。
あと、ついでなのでアニーリング温度について。現在のアニーリング温度５５℃というのは、プライマー購入時にメーカーが書いている温度か何かでしょうか？そうであれば６０℃くらいまでアニーリングできる可能性は高いです。PCRの目的に応じて、PCRの酵素や温度条件などを考えながらされるといいと思います。

お礼

ご返答ありがとうございます。また、返信が遅くなり申し訳ありません。
両サイドのプライマーで挟まれる部分がPCR産物だから、プライマーのMWは関係ないのですね（根本的な原理を考えれば当たり前でしたね）。
また、アニリングの温度ですが、プライマー購入時メーカーの数値で最低値が56度で、参考論文でそのプライマーを使用した際のアニリング温度を55度で行っていたのでそうしていました。同時に他の64度など購入時、高めに記載してあるプライマー4セットほども同時にPCRをかける必要があり、さらに非特異バンドが出やすいのでしょうね。ちょっと温度を上げてもいける可能性があるのですね。チャレンジしてみます。（今まで上手くバンドが出にくくて、アニリング温度を下げる傾向にありました）
本当に初歩的な質問に丁寧に答えていただきありがとうございました。