PCR産物

質問

ある特定遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲにより増幅します。

仮にですが、目的のｍＲＮＡの全長は1000bpで、逆転写反応後プライマーを用いて増幅させると500bpの産物が得られるとします。
その後ネガティブコントロールを行い、さらにF.W.のみとR.V.のみで反応を行います。

この結果(電気泳動パターン、産物の大きさ等)はどのようになると予想されますか？

回答No.2

methyl · ベストアンサー

あくまでも”理論的には”見ることが出来ます。
しかし、通常のPCRではテンプレートを１００万倍以上に増幅すると考えられています。つまり、片側のプライマーだけで増幅させるには、Taqが40cyclesで失活すると仮定すると、少なくとも数万回PCRを繰り返さなければいけないわけです。実際にはprimer dimerであるとか非特異的な増幅も起こりますし、テンプレート量の比較的少ないRT-PCRでは現実的にはかなり難しいですね。
ただし、テンプレートが十分にあれば可能です。というか、シークエンス反応はまさに片側のプライマーで増幅させて、電気泳動で確認することができるわけですよね。
そういうわけで、十分なテンプレート量があると仮定すると、
片側のprimerからmRNAの橋までの距離の部分が最も強く（シークエンス反応と異なりddNTPsが無いので）、そこから分子量の低い方へブロードとなった泳動像が得られると想像されます。

お礼

実に様々な問題が絡んで、現実には理論的にことを進めるのはとても困難なのですね。
しかし、今回の質問は実際に片側のみのプライマーを使用しRT-PCRを行ってバンドが確認できなかった故のものだったので、その理由がわかったのでよかったです。
幾度にわたる質問に対し、迅速かつ丁寧なご回答有り難うございました。

回答No.1

methyl

まず用語の設定が不明ですので、
ネガコン＝テンプレートをMQW
F.W.のみ＝reverse primerの代わりにMQW
R.V.のみ＝forward primerの代わりにMQW
と仮定すると
通常のPCRのサイクル数（２５～４５）で行う限り
いずれもバンドは見られないでしょうね。
primerは片側のみでも一応増幅されますが
通常のPCRが相対量としてサイクル毎に
1→2→4→8→16→32・・・
片側だけだと
1→2→3→4→5→6・・・
だから電気泳動で見える量にはならないですよね。

お礼

稚拙な質問文に対してご回答を求めてしまいすみませんでした。
片側のプライマーのみでも増幅はされるのですね。
しかし結果としてバンドが見られないのは確認できるだけの産物量がないということで、サイクルごとの増加量のご説明からもそのことはよく理解できました。
では、サイクル数を増やせば確認できるだけの産物が得られるのでしょうか。単純に考えるとそういうことになると思うのですが・・・
無知なものでとても初歩的な質問かと思いますが、教えていただけたら幸いです。