CTAB法について

質問

現在、植物のゲノム抽出を行ってます。糖が多い植物のゲノムを抽出するためCTAB法をおこなってます。自分のスキルが足りないと思いますが、なかなかうまくいきません。
また、ネット検索などすると、CTAB法にもさまざまなプロトコールがあるようで、どれを参考にしてみるべきかわかりません。
そこで、どなたか良い方法を教えていただけないでしょうか。お願いします。

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

植物は扱ったことがありませんし、CTAB法を試してみたこともないのですが、ご参考に。

ホモジナイズするときに、いきなり核も壊すような条件でやっておられるのでしたら、まず、核を集めてから抽出するようにすると、細胞質や細胞外マトリックス由来の夾雑物を低減させることができます。
つよい変性剤のはいっていないバッファで（せいぜい0.5% Tritonぐらい）ホモジナイズしたあと、低速度で短時間（たとえば、3000 xG, 1 sec）遠心すると、核は重いので沈殿します。上澄みをすて、必要なら再けん濁、再遠心を繰り返し、核を洗います。これに、あらためて抽出用バッファーをくわえて、DNA抽出に進みます。核を固く安定化するために最初のバッファにはMgCl2を入れておいて、核を壊すときに濃いめのEDTAを加える方法もあります。

RNA抽出のテクニックの応用ですが（RNAは細胞質中にあるので、どうしても多糖類の夾雑物がはいるので）、LiClで沈殿するとグリコゲンなどの多糖類をのぞくことができます。核酸溶液に終濃度2 MのLiClを加え（アルコールは加えません）、エタノール沈殿と同様の条件で遠心します。高分子の核酸は沈殿し、多糖類は上澄みに残ります。
必要なら、何度かLiCL沈殿を繰り返します。
LiClは10 Mでストックできます。酢酸バッファなどで、pHを5くらいにする調整法もありますが、ただの水溶液でかまいません。

回答No.2

gc-ms

うまくいかないとはどういう状況なのかがよくわかりません。抽出物からPCR等で増幅されないということでしょうか？
　また，エタ沈でDNAが見えなくてもちゃんととれていることはあります。私は，昆虫から，主にキットを使うのですが，抽出をおこなっていても，まったく肉眼では見えません。
　また，PCRに使うプライマーの設計，反応条件等は今のままでよいのでしょうか？
　的はずれなことを書いてしまったかもしれませんが，参考まで，