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変異が入ってしまって困っています。
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- Dr_Hyper
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余計な部位に入る変異は、いつも同じですか？ 全くのランダムですか？
- Dr_Hyper
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変異の入った配列のPCR primer Mとその相補配列をもつM' として、insertの5'側の配列をもつprimer5' insert３’末端の相補鎖、、、この場合はユニバーサルprimerをお使いですか？ で1st PCRとは、 5'-M'でPCRをかける M-3' primerでPCRをかける この反応液をまぜて5' 3'のprimerを再度いれてPCRをかけることで変異の入ったinsertを得ます。 primerを４本とおっしゃったので、てっきりこの手法だと思いましたが、違いましたか？
補足
ご回答ありがとうございます。insertの5'と3'の外側のプライマーはユニバーサルプライマーです。手法ですが、4本のprimerを使うことは使うのですが少し違います。宝酒造さんキットにも採用されている方法でMR(Modified Restriction)法と呼ばれているものです。
- Dr_Hyper
- ベストアンサー率41% (2482/6031)
1. 余計な変異の入っている箇所は、primerと無関係ですか？ 2. 1st PCR 2nd PCRどちらとも２０サイクル以下にしていますか？ 3. dNTP MgCl2などの濃度は逸脱していませんか？ primerの張り付きの問題であれば、一本ずつprimerを抜いていったコントロールをとれば目的の長さのinsertが増えているかどうか判断がつきます。
補足
ご助言ありがとうございます。余計な変異箇所はprimerと無関係だと思います。また1st PCR、2nd PCRとはどの段階のPCRだと解釈すればよいでしょうか？dNTP,MgCl2濃度は添付の説明書どおりです。
- alice_with_tak
- ベストアンサー率55% (36/65)
ターゲット遺伝子中に目的部位以外に用いているプライマーが張り付きやすいような配列はないでしょうか？またアニーリング温度が低すぎしないでしょうか？ 上記以外の原因が考えられるようでしたら、PCR以外の方法で変異導入を考えてみてはいかがでしょうか。 http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php3?pGMPID=0707001# 当方ではこちらのキットを用いて変異導入を行っています。
補足
アニーリング温度は60度に設定しております。またPCR以外の方法への以降も視野にいれ検討してみます。
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