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シーケンスについて
論文にあるプライマーを用いてPCRおよびシーケンシングを行ったのですが、 Forward側とReverse側の配列が重ならず、一本の配列にすることができません。 PCRの条件は参考にした論文と同じで、対象とする分類群も一緒です。 どのような理由が考えられるでしょうか。 よろしくお願い致します。
- mini_minivan
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no.2です。 やはり解読した配列の長さが不十分かつ、Ｎの部分があって無理やりに1本の配列につなげたんですね。 その配列をBlastして、その結果をどう考えるか、またそのような不正確な配列の情報で実験的に問題ないのでしたら、いいかと思います。 それというのも、ご存知かと思いますが、相同性検索はあくまでもその遺伝子配列がデーターベース上に登録された遺伝子群に対してどれくらいの類似性を有しているかということにすぎないからです。 いうなれば、どこまで行っても「推測」「推定」であり、「断定」ではないということです。 私個人の感覚としては、 ・50bpにわたってNが多い配列しか得られなかった ・clustalWでconnectできず、手作業でくっつけた ・実験者さんが遺伝子実験をはじめたばかり という点から、再度十分な指導をしてもらいながら、Nのない配列を読み直した方がいいかなと思います。 魚類は分野外なので、できれば同分野の先生や博士に相談されてはいかがでしょう。
その他の回答 (2)
こんにちは。微生物分野で研究をしているものです。 1つ回答が付いていますが、お返事がない様ですね。その後、どうされましたでしょうか？ no.1の方が書いていらっしゃるように、細かな実験条件の記述がないので何とも言えませんが、おそらく一番簡単な理由で最も発生するのは「解読した塩基配列の長さが短い」ことだと思います。 うちでもよくあるんですけど、学生が血相変えて「F側とR側のシークエンスが繋がりません！」ってやってくるんですよね。 よくよく結果を見せてもらうと、目的とする遺伝子配列（塩基配列を読みたい遺伝子配列）の長さに対して、F側とR側からの解読長が短いんです。少なくとも、双方から読んだ長さが真ん中辺で重なって（それも100bpとか結構重なるくらいに）はじめて、一本の配列として認識できますし、解読した結果も正確性が高まると考えられます。 ちなみに私どもは、鋳型のDNAをシークエンスで使用するプライマーで増幅した後、電気泳動して、PCR産物を精製し、それをさらに鋳型としてシークエンスを行っています。 ダイレクトにする場合もありますけれど、no.１の方も懸念されているようにコンタミとか、PCR産物の濃度の問題とかいろいろとチェックしなければならない個所があるんですね。論文に書いてあるプライマーを使ったからといって、誰でもどんな場合でも標的の遺伝子配列が思ったように読めるなんてことはないです。 実験条件を振りかえって、自分の行った操作を確認してみてください。
お礼
回答ありがとうございます． 返信が遅くなり大変申し訳ありません． Clustal Wでアライメントが上手く行かなかったのですが、手作業で合わせたところ50bpくらいはぎりぎり 重なっていたのでなんとか一本の配列にすることができました． ただし、重なっているとは言ってもNが多く、解析には使えそうもありません． この場合、Nが出ている範囲を解析から除けば良いのでしょうか？ 厚かましい対応で申し訳ありませんが、どうぞよろしくお願い致します．
- yuklamho
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『論文にあるプライマーを用いてPCRおよびシーケンシングを行ったのですが、』 質問が凄く素人ぽいのですが、、、 まず、PCRも増えなかったということでしょうか？それなら試料の精製度が低いとか。 『Forward側とReverse側の配列が重ならず、一本の配列にすることができません。』 論文にあるプライマーを用いて、ということは既知の配列なのでしょうか。それなら、 １） Forward側とReverse側の間の距離より短い距離の配列しか読めていない。 ２） 読めた配列そのものが間違い（読めていないとか、コンタミとか）。 『対象とする分類群も一緒です。』 分類群が一緒ってどういう意味ですか？生物種が一緒ということでしょうか？試料はゲノムなのでしょうか、それとも環状DNA?何なのでしょうか。
お礼
返答が遅くなり大変申し訳ありません． 回答ありがとうございます． 今まで遺伝子の勉強をほとんどしていておらず、4年から突然DNAの実験に関わるようになったので 完全に素人です． BLASTにかけたところ、Forward側もReverse側もCytbの領域であるようなので配列の長さが足りないようです． コイ科の魚を対象にしています． 言葉が足らず申し訳ありません．
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