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ImageJを用いて免疫染色陽性率の計算の仕方
Ki６７の免疫染色の陽性率を、このソフトを用いて解析ができるという話を聞いたのですが、まったく使いたかが分かりません。 ヘマトキシリンの青の部分と、免疫染色の茶の部分をわければ解析ができるのでしょうか？ どうか使用方法を教えていただけると幸いです。
- ozigon
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免疫染色を用いて、炎症組織で分泌する細胞が浸潤してきたことを調べたいと思い、いろいろと試していますが、うまく染色することができません。 見たいタンパク質はサイトカインです。LPSを投与して刺激した後に、各種のサイトカインの発現パターンを免疫染色で調べています。 １）分泌蛋白を染色する場合には組織の固定方法をパラホルムアルデヒド で行うことで問題は無いでしょうか？ ２）固定は還流固定の方がいいのでしょうか？ ３）分泌されている蛋白が大量にある場合には、特定の細胞を染め出すということはできないのでしょうか？ ４）染色できるとしたらどのようなサイトカインであり、染色できないのはどのようなサイトカインでしょうか？ ５）使用する抗体によって結果が大きく左右されるものなのでしょうか？ 以上よろしくお願いいたします。
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実験経験の浅い者です。初めて質問します。 細胞質、細胞膜上で発現しているあるタンパクに対する抗体を作成中です。既報にならって、合成ペプチドから抗体(血清)を作成しました。 目的の抗体ができているかを確かめるために、ELISA、ウエスタンブロット、免疫染色をしたのですが、ELSA、免疫染色は問題なく、ウエスタンブロットだけうまくバンドがでませんでした(非特異的なバンドのみ)。 発現しているはずの細胞を抗原としてβ-メルカプトエタノール、SDS入りのサンプルバッファーで溶解処理して、通常のSDS-PAGE、1次抗体は血清、2次抗体はWB用の抗体を使用しました。 免疫染色では、血清を2000倍希釈しても十分染色できました。 高次構造が変わると抗原性がなくなってしまうということなのでしょうか。 だとすると、ウエスタンブロットでは、還元剤なしにするとよいのでしょうか？何かよい方法はありますでしょうか。 よろしくお願い致します。
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お礼
ありがとうございます、ちょっと難しいですががんばってみます。