細胞播種（96well)のコツを教えてください。

質問

閲覧ありがとうございます。
今年10月にバイオ系の研究室に配属されました大学３回生です。

以前細胞の継代について質問させて頂き、お陰様でようやくパスは安定して出来るようになりました。
現在、96wellプレートを用いたグロースのカウント（培養）が上手く出来ず大変困っています。

癌細胞（浮遊、接着）を細胞培養専用のフラスコを使って培養しています。
継代の際は、細胞液をチューブに移して遠心にかけ、上清を吸って培養液（RPMI)を入れ数個のフラスコに分けます。
その際、その細胞液をさらに培養液で希釈し2×10＾4cell/mLで100μLずつ96wellプレートに播種し、毎日グロースを算定板を用いてカウントします。
3回くらい播種しましたが、毎回細胞が思うように増えず、恥ずかしながら多くても本来のピークの1/10程度です・・・

フラスコに継代した細胞は順調に育ち、播種後のプレートを顕微鏡で覗いた時は大体均等に細胞が確認出来るのですが、その後培養液の色はほとんど変わらず・・
プレートは一日UVに当てる、マイクロピペットでのピペッティングを十分に行うなど自分なりに気をつけているのですが、何度も失敗しているので播種する時の操作が悪いと考えてます。

同級生も皆同じ方法で播種し、カウントしているのですが結果は結構ばらついていて、自分のようにピークが極端に少ない人もいるようです。また、一番上手くいっている人でもピークは昨年の先輩のデータの半分程でした。

初めは1×10＾4cell/mLで播種しましたが、育ちが悪いので2×10＾4cell/mLに変更しました。
しかし結果はほとんど変わらず、死細胞が極端に多くなります。

細胞播種の操作で、気をつけるべき事やここで失敗しやすいなど、アドバイスがあれば教えて頂きたいです。

また、プレート内の接着細胞をはがす際、どのくらいの間EDTAに浸ければ良いのかも知りたいです。何度もピペッティングすれば大丈夫なのでしょうか？
あまり長い間EDTAを入れていたら細胞が死んでしまう様なので…

質問が多くて申し訳ございませんが…
安定して良い結果を出せるように頑張りたいので、よろしければアドバイスをお願いします。

回答No.1

thegenus

他にどういう配属があるの？
将来も培養作業しないなら無理に頑張る事ないよ。
友達に甘えながらする事です。ノウハウだから独りつっばしっても上手くいかないよ。ペレットを見ずに吸う人はそうなんだよ。
メクラウチは事故の元でしょ。
顕微鏡で観るんですよ。全ての作業の前後で。目視で確認です。
そういうノウハウを指導されないなら真面目にならなくていいです。遊びなさい。課題よりも細胞を眺めて何かを発見なさい。それが生物学生命学です。

去年との比較は、フラスコの細胞の性質があるからね、継代のやり方にまでさかのぼります。
培養というのは細胞の飼い方なんですよ。剥がし方じゃないんですよ。

飼い方で性質が違ってきます。その性質を調べてるんですよ。話がアベコベなんだけど…アベコベ馬鹿先生ばっかりで教室ごと分かっていないのが普通だからね。あなたが苦しむことありません。

友達の継代を使う。
無理しないで友達に飯をおごる事。