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レーザーマイクロダイセクションの組織片のPCR
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- ga111
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＞かなり離れた施設のためレーザーの波長はすぐには確認できませんが、マニュアルに従い自分で設定した項目はLASER SPOT SIZE: 30 um，POWER: 25-35mW，DURATION: 5-6 msでした。 自分で設定しないで、メーカーに必ず行くはずのお勧めの条件を教えてもらいましょう。 ＞コントロールは取りましたが、必ず行くはずの切片およびレーザーを当てたPositive controlでPCRがかからず、PCR全体が失敗しているような状態です（もちろんPCRのポジコンDNAはちゃんと増幅されています）。同じブロックのパラフィン切片から抽出したDNAはPCRがかかり、レーザーキャプチャーの工程を経るとバンドが出なくなってしまいます。 もちろん、ダメなときも、同じブロックのパラフィン切片から抽出したDNAはPCRがかかることは、同時にランしてチェックしていますよね？？？ その同じブロックのパラフィン切片に、その抽出キットを適用することは可能ですか？それで抽出キットがワークしているかどうか分かりますよね？ ＞また、A260/280の比が約0.9というのも気になります。おそらく抽出の際のProtease K（熱変性済み）がサンプルに混入しているので280の値が高く出ているのだと思うのですが、DNA抽出キットのプロトコールによると、95℃10分でProtease Kを失活させたら、ダイレクトにPCRサンプルとして使えると書いてありました。 さらに、Protease をしっかつさせる操作がいるかもしれません。フェノールやProtease 阻害剤など。
- ga111
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レーザーの波長が書いていないので、分かりません。レーザーが超波長のUVに属するのなら、DNAは多少壊れるでしょう。 >取っている場所は大丈夫だと思います。 これもコントロールを取りましたか？ 違う場所のコントロール、必ず行くはずの切片のコントロール。 レーザーを当てたPositive Controlも取ります。 ＞パラフィン切片からDNAを抽出した場合はけっこううまくPCRがかかっていたのですが、 もちろんそのDNAは他のうまくいかない実験でランしてますよね。
- ga111
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Positive Contolは考えられる範囲でほぼ完璧に取っていますか？ レーザーを当てたPositive Contolがあればさらに良いと思いますが。
補足
さっそくの回答ありがとうございます。 取っている場所は大丈夫だと思います。 パラフィン切片からDNAを抽出した場合はけっこううまくPCRがかかっていたのですが、より詳細な部位を特定してレーザーキャプチャーをしようとしてから殆ど増幅がみられなくなりました。 レーザーでDNAが劣化するというのはあるのでしょうか。機械は初期の古いタイプなのでそれも気になっています。
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