とりあえずプラスミドを増やそうとプラスミドだけをコンピテントセルに導入しようとしているのですが、なぜだか寒天培地に生えないんです。
抗生物質入りのにも抗生物質なしのものにも生えなくて困ってます。
同濃度の抗生物質入りの液体培地では増殖が確認されるのですが、寒天培地には生えないというのはやっぱり変ですよね？
播くときの濃度が薄すぎるのかと思い、遠心分離して濃度を上げたんですが、それでも駄目でした。
ちなみに多量にLB培地を作成し、そこからフラスコに100ｍLほど採ってアガロースを加えて滅菌しています。
つまり液体培地と寒天培地はアガロースの有無しか違いがありません。
形質転換については経験のある方にもお願いして実験してもらいましたが失敗されてました・・・ということで形質転換を行うときの操作に問題があるとは考えにくいかと思っています。
解決策が見出せず本当に困ってます。
心当たりのある方、よろしくお願いします。
投稿日時 - 2010-03-17 11:22:53
> お礼が遅くなって申し訳ありません。
> 培地を作るのにミリQを使ってたような気がします・・・
> ミリQの方がコンタミとかもなくていいかなと思っていたのですが、
> なぜ増殖が遅くなるのですか？
LBだけではメタルがどうしても不足するため、
MilliQで培地を作ると増殖がかなり遅くなります。
これが最小培地ならばびっくりするほど遅くなります。
ですので培地をつくるときはDIWやROを使う人が多いようです。
とはいえ「MilliQ派」の人もそこそこいます。
たとえばメタルと結合する様なたんぱく質を扱う場合など
綺麗な水の方が安心だから・・・とか、そういうことでしょう。
ちなみに、いずれにせよオートクレーブするので
水道水で培地を調製しても全く問題はありません。
それどころか、むしろ増えるのが非常に速くなるので
「水道水派」のひともかなりいます。
私は学生のころは水道水を使ってましたが、
メタルバインディングのたんぱく質を扱った頃から
DIWを使うようになりました。だって水道水だと
カドミウムとか入ってたら困るじゃないですか？
（たんぱく質と関係なく困る気もしますが・・・）
投稿日時 - 2010-04-08 12:16:41
お礼
なるほど～
確かにオートクレーブするなら水道水でも問題なさそうですね。
でも研究所によって水道水の組成が微妙に違ってくるような(笑)
一度DIWで作り直してみます。
ありがとうございました。
投稿日時 - 2010-04-08 17:10:20
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ベストアンサー以外の回答（7件中 1～5件目)
#4です。
> プレートが悪いというのは具体的にはどのような感じでしょう？
> 組成は間違ってませんし、量が少ないということですか？
組成を間違っていないとしたら、例えばMilli-Qで作っているとか。
まあ大抵の場合はMilli-Qで作っても遅いだけでちゃんと増えますが。
あとは、とうぜんちゃんと冷えていないプレートにまいてもダメですが、
といってもそんなことはおそらくしないでしょうからねえ・・・。
最初に疑ったのが、DH5αのコンピテンシーが低いかどうかですが、
otoykmorfさんのプロトコルを見ると大量にプラスミドを入れているようなので
（私の場合はコンピテントセル20uLにつきプラスミド1ngしか入れません）
おそらくコンピテンシーは問題にならないんじゃないかと思います。
次に疑わしいのは、バイアビリティが低いんじゃないかということです。
使ってるDH5α、実はほとんど死んでるんじゃないかな？と。
例えば購入したものを保存するまでの間に誰かが室温に放置したとか、
一度融かしたものを誰かが再度ディープフリーザに入れたとか。
液体培養で対数増殖期に入るまでの時間が異常に長い場合は多分それです。
あと、SOCがイケテナイ可能性はないですか？既製品なら問題ないでしょうけど。
もし既製品ではなく自作だとしたら、一度LBで回復培養してもいいかもしれません。
それでうまくいくとしたら、SOCの組成が間違ってた可能性が高いです。
他には、湯浴につかった恒温槽の温度は正確ですか？
例えばうちのラボでは37度に設定したのに50度近くまで温度が上がる
という事件が一度ありました。気付かなかったら大変なことになってました。
投稿日時 - 2010-03-18 23:20:41
とりあえず液体培地で増えるなら、液体培地で回復培養して
それをプレートにまいたら生えるんじゃないかと思いますが、
「抗生物質なしのものにも生えない」というのは異常事態ですね。
おそらくコンピテントセルがおかしいのではないかな？って気がします。
プラスミドに組み込んだタンパク質の毒性が高い可能性は
プラスミドを増やすための大腸菌では少ないと思いますし。
以下の実験で問題を切り分けてみればいいのではないでしょうか？
(1) 別のプラスミド・同じ大腸菌を使ったプレート培養
(2) 同じプラスミド・別の大腸菌を使ったプレート培養
(3) 別のプラスミド・別の大腸菌を使ったプレート培養（ポジコン）
「別の大腸菌」はBLとかJMとかの(DE3)いいです。
(1)が×で(2)が○なら大腸菌が悪い、
(1)が○で(2)が×ならプラスミドが悪い。
(1)も(2)も×ならプレートが悪い、
(1)も(2)も○なら腕が悪いと言うことだと思います。
投稿日時 - 2010-03-18 03:05:14
お礼
液体培地で回復培養したものを播くとコロニーができました。
とりあえずコロニーを拾って増やしてプラスミドが目的のものかチェックしてみます。
今後の実験のことを考えると原因をつきとめないといけませんね・・・
プレートが悪いというのは具体的にはどのような感じでしょう？
組成は間違ってませんし、量が少ないということですか？
投稿日時 - 2010-03-18 12:02:37
とりあえず液体培地で増えるなら、液体培地で回復培養して
それをプレートにまいたら生えるんじゃないかと思いますが、
「抗生物質なしのものにも生えない」というのは異常事態ですね。
おそらくコンピテントセルがおかしいのではないかな？って気がします。
プラスミドに組み込んだタンパク質の毒性が高い可能性は
プラスミドを増やすための大腸菌では少ないと思いますし。
以下の実験で問題を切り分けてみればいいのではないでしょうか？
(1) 別のプラスミド・同じ大腸菌を使ったプレート培養
(2) 同じプラスミド・別の大腸菌を使ったプレート培養
(3) 別のプラスミド・別の大腸菌を使ったプレート培養（ポジコン）
「別の大腸菌」はBLとかJMとかの(DE3)いいです。
(1)が×で(2)が○なら大腸菌が悪い、
(1)が○で(2)が×ならプラスミドが悪い。
(1)も(2)も×ならプレートが悪い、
(1)も(2)も○なら腕が悪いと言うことだと思います。
投稿日時 - 2010-03-18 03:03:14
トランスフォーメーション前のコンピテントセルはLB brothで増えますか？
下記は可能性としては低いのですが
プラスミドは購入されたものを直接使用されているのですか？
製品として購入しても意外とプラスミドは壊れているものもあります。
addgene等から手配しているものは民間には販売せず、非営利団体には原則大幅に安価なのでノークレームでお願いされる事もあるでしょう(そのため日本の商社は手が出せない代表的な団体です)
シークエンスする必要もあるかもしれません(コストは高いですが)。
他のプラスミドで代替できるのであればそちらも試行してみるとか...
何れにしましてもまずコンピテントセルがちゃんとしているかどうかから始められる事をお奨めします。
投稿日時 - 2010-03-17 16:39:32
