• ベストアンサー

平滑化後のligationについて

T4polymeraseで平滑化したインサートってリン酸基がついているのでしょうか? 平滑化したインサートと、平滑化し、SAPで脱リン酸化したベクターでライゲーションしたのですがコロニーが全く生えてきませんでした。 なにか一般的につまづくようなところと解決法などありましたら教えてくださいませ。

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
  • Mr_Spock
  • ベストアンサー率75% (57/76)
回答No.2

T4 DNA polで末端のリン酸基がはずされる反応はありません。 T4 polで平滑化するのは簡単そうな反応ですが、じつは非常にトリッキーです。T4 polは3' exonuclease活性を持ち、3'突出末端を削る平滑化もできますが、活性が強いので二本鎖部分でも容易に3'末端を削り込んで陥没させるので、平滑化の失敗が起こりがちです。 酵素量を下げる、反応温度を下げる、反応時間を短くする、反応後の失活を速やかに行う(高温で失活させようとすると、失活する前に高温で削れこみが促進する可能性があるので、フェノール抽出がよい)などでコントロールします。

tnlu
質問者

お礼

コロニー数は少なかったですが無事クローニングできました。 ありがとうございました。

全文を見る
すると、全ての回答が全文表示されます。

その他の回答 (1)

  • samkuma
  • ベストアンサー率50% (9/18)
回答No.1

通常のPCR産物はリン酸化されていません。 プライマーを設計する際にリン酸化してくれるサービスがあります。 それか,T4 Polynucleotide Kinaseでプライマーをリン酸化するか,産物をリン酸化してからLigationすればOKです。 これは個人的な感覚ですが,平滑の場合もベクターを脱リン酸化せずにLigationしても問題なく入ります。その代わりコロニーを16個くらいつつきますけど。。。

tnlu
質問者

お礼

なんとかクローニングできました。 ありがとうございました。

全文を見る
すると、全ての回答が全文表示されます。

関連するQ&A

  • 平滑末端のライゲーション

    平滑末端同士のライゲーションは効率が悪いのであまりやらないものなのでしょうか? 上手な人や運がよいときはどのくらいの確率で成功するものなのですか? 経験者の方教えてください。 ゲル切り出し後、SAP(promega製)を使って脱リン酸化をしてライゲーションをしたのですが、セルフライゲーション産物ばかり出てきます。 SAPの反応は説明書通り、37℃、15min、65℃、30minとやりました。 ベクターは10kbp、インサートは1kbpです。

  • 平滑末端(blunt end)のライゲーション成功率

    ライゲーションを行ったのですが32個コロニーがあってやっとひとつインサートが入っているものが見つかりました。確率的には1/32ですよね。 ライゲーションの成功率ってここまで低いものなんですか? 上手な人がやればどのくらいで成功するのですか? 運なのでしょうか? インサートが入っていなかったものはベクターのセルフライゲーションが起こったものです。 ベクターの脱リン酸化も行ったのですが、 それが不十分だったのでしょうか? それともインサート:ベクターの混合比がまずかったのでしょうか? 平滑末端だったので難しい実験であることは間違いないですが。 大きさですが、ベクターが8000bp、インサートが 1500bpです。 ゲル抽出をした後の電気泳動のバンドの濃さを見て 同じ液料入れたのがまずかったのかもしれませんが。 モル比は1:1がいいんでしょうか?

  • アダプターライゲーション?について

    全長約6kbのベクターをEcoRI/XbaIで切断し、そこに大体55kbのアダプターをライゲーションしようと試みているのですが、なかなか成功しません。大腸菌のコロニーが生えてこないのです。ベクターのみのトランスフォーメーションでは、コロニーは生えてきませんでしたし、アダプター生成時のアニーリングがまずかったのか、他に原因があるのか分かりかねています。 ベクターはアルフォス処理はしておらず、インサート、つまりアダプターの方にはリン酸基が付加されていないので、理論上繋がることはつながるはずなのですが。 何か解決策が内ものでしょうか?

  • 平滑化;klenowかT4DNA polymeraseか

    宜しくお願いします。 ライゲーションを目的として、2本鎖DNAを平滑化する場合、成書にはクレノーを用いた例が殆どですが、なぜT4DNA polymeraseが第一選択ではないのでしょうか? 以前から疑問だったのですが、この度質問するにあたり、複数の業者に問い合わせてみたところ、クレノーはfill inと同時に1塩基される為不向きなので、T4DNA polymeraseを用いて下さいとの回答でした。 それならば何故、教科書にはクレノーの例ばかりなのでしょうか。勿論クレノーを用いても平滑化が可能な事は、理解出来ますが、第一選択としては、T4DNA polymeraseの強力なエキソヌクレアーゼを考慮したとしても、こちらの方が良いと思われるのですが。 上記の様な理由を、どなたかご存知でしたら教えていただければありがたく思います。

  • ライゲーション

    ベクターにinsert DNAを1種類の制限酵素でライゲーションする際,ベクターは制限酵素で切断後,アルカリ性フォスファターゼ処理をして,リン酸基を水酸基にかえてセルフライゲーションを防ぎます. しかし,この状態ではinsert DNAとベクターは2本鎖のうちの1本鎖だけでライゲーションすることになるのですか??もう片方の鎖は両方とも水酸基になっていますよね.insert DNAの方は3'-OHで,ベクター側はアルカリ性フォスファターゼ処理したので5'-OH. 実験は普通にうまくいっているのですが,原理がいまいちよく分かりません.

  • ライゲーションが上手くいきません

    ベクターの構築をしてるのですが、 インサートが5kbでなかなか上手く入ってくれません。 bluntと、5’突出末端でライゲーションしトラフォメ後、コロニーはでるのですが数も30こくらいで、多くはありません。 N,C(ベクターのみ)はコロニーがでていないのでセルフライゲーションは多くないのですが、目的のインサートを含んだコロニーがないんです。どうしたら良いでしょうか?

  • 制限酵素サイトの異なるライゲーションについて

    現在、あるベクターから別のベクターへ配列を移し替えようとしているのですが、ベクターとインサートの制限酵素サイトが合いません。ベクター側はEcoRIとBamHIで、インサート側はEcoRIとNotIで切り出したいと考えています。このような場合何かいい方法はありませんでしょうか? 現在考えているのはベクター、インサート共に両側を平滑化する方法なのですが、向きが決まらないことと、現在まで平滑末端でのライゲーションの経験がなく、研究室内でも成功率が低いので他にいい方法がないかと思っています。 もしくはインサート側をPCRで増やすことも考えたのですが、プライマー作製の時間を考えると、平滑化したほうが手っ取り早いのではないかと思っています。 また、現在まではライゲーションによって環状DNAを作ることしか行ったことがないのですが、上記のような末端を持つもの同士をライゲーションした場合、EcoRIのみで結合した直鎖状のDNAが出来るのでしょうか?もしそうなのであれば、その後末端を平滑化してさらにライゲーションするという方法もありますよね? 勉強不足で申し訳ありませんが、何かいい知恵をお持ちの方がいらっしゃいましたら拝借させていただけないでしょうか?

  • ライゲーションがうまくいきません

    目的遺伝子をTAクローニングしたのですが、その後の発現ベクターへの ライゲーションがどうしてもうまくいかず困っています。 インサートは約900bpで、ベクターはT7プロモーターのpET-9a(4341bp)です。 インサートとベクターを2種類の制限酵素(Nde1とBamH1)で5時間ほど処理し、 T4 ligaseを用いて14℃オーバーナイトでライゲーションしています。 ライゲーション後はBL21(DE3)pLysSを使用していますが、コロニーが全く発育しません。 DE3遺伝子保有株のため、IPTGも培地に添加しています。 制限酵素処理後、インサートも目的の長さのものが得られていますし、 電気泳動で確認する限り、切れ残りはないと思います。 制限酵素処理したベクターも未処理のものに比べ泳動されずらくなっているのが確認できるので 酵素処理で開環していることも確認できています。 インサートの開始コドンの読み取り枠もずれていませんし、 インサートもベクターも1μg超ぐらいの濃度でライゲーションを行ってるので、 量が少ないということも考えずらいです。(ベクター:インサート≒1mol:5molです。) 何か原因があるはずなのですが、思いつきません。 何でも教えて頂けると大変助かります。よろしくお願い致します。

  • ライゲーション→トランスフォーメーション

    ライゲーション→トランスフォーメーションが上手くいきません. トランスフォーメーション後のプレートにはコロニーは沢山生えてきます.ネガティブコントロールとしてベクターのみでライゲーション→トランスフォーメーションするとプレートには殆どコロニーは生えてきません. しかし,コロニーを拾ってMiniPrepし,適当な制限酵素で切断したりしてアガロース電気泳動すると予想だにしないバンドが出てきます.20個くらいに対し1個は予想されるところにバンドはくるのですがセルフです. ベクター(10 kbp)の方はBamH Iで制限酵素切断して,BAP処理をしています.インサート(2 kbp)はBgl II及びBamH Iで切断しています.Bgl IIとBamH Iの切断部位の相同性を利用したライゲーションです.濃度はベクターが0.03 pmolでインサートは0.3 pmolです. ライゲーション時間は1,3,17時間試しましたが,全てダメでした. 大腸菌はJM109です. ライゲーションが上手くいっていないのか,それとも大腸菌の中で異常が起きているのでしょうか?

  • pGEX-6p-1の形質転換

    GEヘルスケアのベクターを使ったライゲーションとトランスフォーメーションがうまくいきません。以下に実験の概要を書きますので、どこに原因があるのか分かる方、アドバイスよろしくお願いいたします。 Total RNA抽出 ↓ cDNA合成 ↓ 目的遺伝子の部分配列(1521bp)プライマーでPCR ↓ 5'(Foward)末端にBamH1配列、3'(Reverse) 末端にStop Codon 配列を組み込んだプライマーで上記のPCR産物をテンプレとして再びPCR ↓ ゲル抽出 ↓ ライゲーション(p-GEM-T-easy Vector Systems, Promega)とトランスフォーメーション(大腸菌はDH5α) ↓ コロニーPCR(M13プライマー)でインサートチェック ↓ プラスミド抽出 ↓ シークエンス解析(全配列は読めなかったが、BamH1、Stop Codon配列は確認) ↓ 制限酵素処理(BamH1、EcoR1)、同時にpGEX-6p-1ベクターも同じ制限酵素処理 ↓ ゲル抽出 ↓ ライゲーションとトランスフォーメーション(大腸菌はBL21、GEから購入し、自分で培養) ↓ コロニーPCR(pGEX sequencing Primer使用、ただし、経費節減のため、GEのものではなく、Operonに作ってもらった) ↓ なぜか、160bpくらいにバンドが出た pGEXのライゲーションにはp-GEM-T-easy Vector Systems(Promega)を流用しています。 BL21には空ベクター(pGEX)が導入されることはコロニーPCRで確認しています。 後、制限酵素処理したベクターに脱リン酸化処理などもしてみましたが、結果は同じでした。 ですので、おそらくライゲーションがうまくいってないのでは、と思います。しかし、どうすればよいか分からないため、困っております。長文ですいませんがよろしくお願いいたします。