- ベストアンサー
プライマーの除去について
RNase_Pの回答
- RNase_P
- ベストアンサー率34% (9/26)
後は限外濾過などの方法もあります。 どの手法をとるにしろ 総量の減少は避けられません。 質問には濃度しか書いてありませんが 総量はどのくらい減少しているのでしょうか？ また濃度測定はどのように行っていますか？
関連するQ&A
- アガロースゲル電気泳動におけるPCR産物バンドの乱れ
600 bpくらいのDNA配列をPCRで増やし、その産物をPEG沈して精製しているのですが、PCR直後の電気泳動（1.5% TBE gel)では1本のバンドなのですが、PEG沈後の電気泳動では2本になっています。 分子量で見ると、産物のバンド（600 bp）に加えて、450bp程度のバンドが新たに出現します。精製中に分解したのでしょうか？（でも、DNaseのコンタミだったらもっとズタズタに切れますよね）。それとも、精製過程で産物の一部が何か高次構造のようなものをとって、電気泳動上で二本になって見えるのでしょうか？ 原因についてご存知の方、あるいは同じ経験をされた方、教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAの精製で注意する点
PCR法によって増幅したDNAを制限酵素処理しライゲーションする実験をしているのですが、PCR産物が酵素で切断できていない可能性があり(電気泳動の時点では判断つかないので)、サイト検索で調べたりなどしてDNAの精度が問題となることが多いと書いてありました。PCR産物の精製はフェノール/クロロホルム抽出後エタ沈でしています。フェノール/クロロホルム抽出→クロロホルム抽出→エタ沈一晩→エタノールで2回洗い→乾燥です。大雑把な説明ですが、 1)フェノール/クロロホルム抽出 2)エタノール沈殿 について特に注意点などありましたら助言お願いします。なお、今使っているプロトコールは他の人で成功しているものなので、それ自体には間違いはありません。
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAが消えた！
組織からDNAを採取し、フェノール→フェノクロ→クロロフォルム処理→エタ沈で回収したDNA（DNA(1)）がちょっと薄かったので、クロロフォルムに残った層から再度回収して（DNA(2)）、最初のDNAに混ぜました（DNA(1)＋(2)）。volumeを減らして濃度を濃くしたかったため、再度エタ沈したところ、DNAがなくなってしまいました（泣）(1)と(2)は濃度を測定して50ng/ul前後ありました。しかし、(1)＋(2)は100ng/ulぐらいはあるはずが、0.1ng/ulしかないんです。最後のエタ沈は、TEと1/10量の3M酢酸ナトリウム、2.5倍量のエタノールを入れて混ぜ、-80℃15分、遠心12000rpm 30minしました。70%EtOHでリンスする時に遠心機利用が他の実験者とバッティングしたため、10分くらい70%EtOHを入れたままおいてしまいましたが、4℃12000rpm10min遠心して乾燥させ、TEに溶解しました。DNAが回収できなかったのは、どこがいけなかったんでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAの安定性について
シークエンス解析をしています。対象は、ゲノムをテンプレートとして増幅したDNA断片（PCR産物）をエタ沈したサンプルです。解析の結果を見ると、増幅時のプライマーが残っているのか、ノイズが多くてきれいに読めませんでした。エタ沈の条件を変えたりしたのですが、あまり効果はありませんでした。市販の精製キットでは少し効果があるようでした。ところが、３週間ほど冷蔵保存したPCR産物で解析したところ、以前の精製条件でも、ノイズが減ってきれいに読めるようになりました。そこで質問なのですが、冷蔵あるいは長期保存することでサンプルがきれいになって（例えばプライマーが分解して）、シークエンスがうまくいくというようなことがあるのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- PCR産物4の制限酵素処理について
ヒトの細胞からゲノムDNAを抽出し、PCRにて増やしたDNAを制限酵素処理しているのですが、上手くいきません。どなたかご指摘の方お願いします。 制限酵素名：KpnI 10×L buffer 1μL PCR産物（フェノクロ処理、エタ沈、真空乾燥し滅菌水に溶かしたもの) 8μL KpnI 1μL 反応時間：1時間 これで行っているのですが全く切れません。試しに一日置いたのですが、全く一緒でした。 ちなみにKpnIは別の人が、プラスミドを切るのに使って、成功したので、失活はないと考えられます。 また、PCR産物も確認したところ目的とするものでしたので、PCRは成功してます。
- 締切済み
- 生物学
- エタ沈後のＤＮＡ Sequenceの結果で
エタ沈後のＤＮＡ Sequenceの結果がいつも50～75ｂｐあたりの波長が悪く読み取られ、信頼度が低く使えません。（それ以外のところははきれいに読めます。） どうしてですか？
- 締切済み
- 生物学
- アルカリSDS法におけるＤＮＡとプラスミドの分離について
大学生になり、生物実験でアルカリＳＤＳを行っている者です。 アルカリＳＤＳによるゲノムＤＮＡとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは１本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、とありました。そしてボルテックスはsolutionIIを加えた以降は禁止で転倒混和ですが、これは激しいボルテックスによりゲノムDNAも粉々になって上清画分に出てきてしまうため、また、膜にゲノムDNAは結合していて膜とともに沈殿させることができるが、DNAが細かく切れると膜とともに沈殿させることができないため、という文もありました。疑問に思うことは以下の6つです。 (1)一本鎖になるとニックが入りやすくなるのに、プラスミドは二本鎖に戻し、ゲノムDNAを一本鎖のままにすることが、ボルテックスなどでゲノムDNAが細かくなるのを防ぎたいということと矛盾している気がします。細かくなると不都合になるのになぜわざわざ一本鎖にするのでしょうか？ (2)その後のエタ沈でDNAを沈殿させますが、一本鎖のほうが二本鎖より沈殿させやすいのしょうか？原理的にはDNAはエタノールに不溶性なため沈殿することを考えると、一本鎖でも二本鎖でも不溶性なことには違いがありませんよね？一本鎖の方がもつれて絡まりやすいから凝集するのでしょうか？ (3)ゲノムDNAは菌体の膜に結合していて一緒に沈殿しやすいというイメージがよく分からないのですが、膜に所々DNAが細胞骨格などとともに結合しているのでしょうか？何かのタンパクを介しているのでしょうか？ (4)solitionIでTris-HCl(pH.8.0)などの緩衝液を加え、菌体をボルテックスして懸濁する必要があるのは後のsolutionII以降の操作のためにどのような目的がありのでしょうか？EDTAでDNaseなどを不活性化するのは分かるのですが…。またグルコースも加えるのは何のためなのでしょう。Tris-HClで十分緩衝液になっている気がします。 (5)エタ沈の前に、フェノールクロロホルム抽出をはさむプロトコールがありました。フェノールクロロホルム抽出をはさまなくても、solutionIIのアルカリ性でタンパクは変性し、不溶性となるので、核酸と分離できるはずですが、はさむ方法もあるのは、よりタンパクを取り除くためでしょうか？ (6)こちらは、確認質問なのですが、エタ沈の目的は核酸の沈殿であって、タンパクとの分離はできませんよね？ ちまちまとすみませんが、どなたかよろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
補足
失礼しました。 濃度測定はNanoDropを使って測定しています。 溶液が25ulあったので総量は10ugぐらい減っていると思います。