リアルタイムPCRにおいて陰性コントロールで…

質問

他施設で成功した同じ実験系でリアルタイムPCR(SYBER Green系)を行いましたが、陰性コントロール及びサンプル全てのCt値がほぼ同じ値で上がりました。そのため、コンタミを疑いPrimer以外の反応液は新しいものに全てを変え再試を行いましたが、同じ結果となりました。原因はPrimerでしょうか？Primerは成功した同じ塩基配列で設計したものを使用しています。他に考えられる原因はありますか？初心者なので初歩的な質問ですが、よろしくお願いします。

回答No.1

j_chan · ベストアンサー

こんにちは。
全てのサンプルで認められるということで、試薬もしくは器具が汚染されているかもしれませんね。よくあることですが、ピペットマンが汚染されている可能性はありませんか？
原因究明の方法としては、・試薬を一つだけ抜いた系を全ての試薬に対して試してみる。
・器具を変えてみる。
・環境自体が汚染されている可能性も考え、部屋や設備を洗浄する。
などが考えられるでしょうか。
実験頑張ってください。

お礼

返信が遅くなり申し訳ありません。
primerを精製しなおし、陰性コントロールが反応しなくなりました。
おそらく、primerが汚染していたと思われます。
本当に参考になるアドバイスありがとうございました。
ＧＷ前に原因がわかってすっきりました。

回答No.2

noname#99244

同じように上がったとありますが、何サイクルで上がってきましたか？融解曲線は確認していますか？
　サンプルが何かわかりませんが、いくら特異性が高いプライマーを作って、きれいなサンプルを増やしても、40サイクル付近になると、よほど運が良い実験系でない限り非特異的産物ができて緩やかに上がってきてしまうことがあります。
　陰性コントロールやサンプルで増えたものが、陽性のコントロールで増えたものと同じかどうかは、融解曲線（melting curve）を比較すれば、融解曲線のピークを比較して、陽性と陰性が同じところにピークがあれば、同じものが増えている可能性が高いので、ほぼわかります。また、リアルタイムPCRが終了した後の産物をアガロース電気泳動してみて、陽性のコントロールと同じ長さ（もちろん設計した長さでなくてはだめです）の「単一」の産物ができていればそれはコンタミです。
そういうときは（うまくいったPCRの溶液や陽性のサンプルが）コンタミした可能性が高いので、前の方のいうようにコンタミを除去して下さい。
　ピークが重なっていなかったり、産物が複数できていたり、意図しない産物ができている場合は、あなたのサンプルの中の意図しないところにプライマーと類似の配列が存在して、プライマーがうまくはたらいていない可能性があります。

お礼

返事が遅くなり申し訳ありません。
あれから、primerを作製し直し再試したところ、陰性コントロールは反応しませんでした。primerは精製方法を変え同じ塩基配列で作製しました。
陰性コントロールが反応した時の融解曲線のピークはすべて同じでした。おそらく、primerがコンタミしたのが原因だと思います。
今後は、記載して頂いた方法で検討してみます。
本当にわかりやすいアドバイスありがとうございます。