non-RIを用いた効率的＆確実なスクリーニング法についてご教授を

質問

私は主にcDNAをレース法やライブラリーを使ってとってくる作業をおこなっております。以前にいたラボではRIが使えましたので、30merほどのプライマーをプローブとしまして3'末テーリング法でラベリングし、サザン＆コロニーハイブリなどをおこなっていました。プライマーを用いますので擬似クローンは出るものの、洗浄などをカウンターでチェックすることができるなどバックを抑え、RIのメリットを生かしてうまくスクリーニングが出来ていたのですが。
現在のラボではRIが使えず、初めはDigラベリングキットをその後知人に勧められてアルフォスダイレクト（CDP-star)を用いております。プローブは500-1kbpほどのサブクローンをアニールするのはだいたい200-300bpほどでしょうか。
いろいろハイブリ温度など条件を変えましてやっているのですが、その時その時でうまくいったりしくじったりと安定してスクリーニングできないことにイラっとしております。いくつか遺伝子をとっているのでいつもプローブなど条件は変わっていますが。特に大腸菌をメンブレンに転写するコロニーハイブリが安定しません（４h程度のハイブリ）。恐らくプローブ量が多いことが原因だとは思っておりますが。
こうしたnon-RIを用いたスクリーニングでコツなどありましたらよろしくお願いいたします。コロニーPCRなどのコツでも結構です。特に200-300bpをねらってやったことがあるのですがうまくいった試しがないもので。

回答No.2

geneticist12

DIGでのプラーク/コロニーハイブリの経験があります。
スクリーニングの時は、大きいメンブレンや、多数のメンブレンを処理するので、ハイブリ、抗体反応、発色反応がとかく均一にはいきにくいものです。バックが真っ白でそのなかに当たりのシグナルがうっすら見えることもあれば、一方でバックがゴリゴリに染まっている中に、とりわけ濃く染まっている当たりのシグナルがあったりします。なれればそれでもぜんぜんいけるのですけれど。

なるべくそうならないように、プローブや抗体の濃度を犠牲にしても液量を多くし（その代わり、必要に応じて処理時間を延ばす）、メンブレンが均一につかり、メンブレンを重ねても、自由に動くようにしたほうがいいです。できたら重ねないで一枚ずつ処理すればなおいいです。

コロニーハイブリのときは、コロニーに厚みがあるので溶菌処理をしっかりやり、メンブレンによくしみこむようにします。debrisがバックグラウンドを高くしますので、固定後、よく洗い落とします（やわらかいブラシでこすって洗うというプロトコールもあるほど）。

それと、ちょっと引っかかったのですが、コロニーハイブリを、サブクローンしたDNAのプローブでやっておられますが、ライブラリーのプラスミドベクターとプローブのベクターがハイブリしませんか？インサートを切り出したとしても、ベクターは完全に除けていないものですから。
インサートだけをPCRで増やして精製したものをプローブに使うと良いいと思います。

回答No.1

MIYD

RIとDIGの違いではなくて、
ハイブリかトランスファーの問題のようですが、
コロハイ用のプレートの培養時間は条件検討しているのでしょうか。
大腸菌が増えすぎるとうまくトランスファーされないので、
通常のO/Nよりもちょっと短めだったと思います。

コロニーPCRは大腸菌が入ってさえいればいいので、
できるだけ少なく取るのがコツだと思います。
それでもうまくいかないのでしたら、
突っついた後にTE(or DDW)10~50ulいりのチューブでチップを洗って、
そこから1ulを反応系に持ち込むと夾雑物が除けて増えやすいというヒトもいます。

お礼

ご指摘ありがとうございます。
プレートは植え替えて5-10時間程度だと思います、あまり意識していません。おっしゃるとおり菌が多いのが原因の一つだと思います。その点改善していこうと思います。
コロニーPCRはご指摘同意いたします。ありがとうございました。