制限酵素処理の方法について
- プラスミドの制限酵素処理について質問です。現在、50マイクロリットルの滅菌水に溶けたプラスミドを二つの制限酵素で切断し、ゲル抜きしたいのですが、反応系の量についてよく分かっていません。
- 100マイクロリットルの反応系を作りたいと考えていますが、正しい量なのか不安です。特にbufferの量について教えていただきたいです。
- 使用する物質の量を以下に記します。プラスミド：50マイクロリットル、EcoR1とXho1用の10×buffer：10マイクロリットル、制限酵素EcoR1：5マイクロリットル、制限酵素Xho1：5マイクロリットル、滅菌水：30マイクロリットル。合計は100マイクロリットルです。
- ベストアンサー
制限酵素の仕方
現在、プラスミドが50マイクロリットルの滅菌milliQ水に溶けていて、これを二つの制限酵素で切断しゲル抜きしたいのですが、制限酵素処理の反応系の量がよく分かっていません。 100マイクロリットルの系を作ろうと思っていて、以下のように量を出したのですがこれでいいのかどうか（特にbufferの量）教えてください。よろしくお願いします。 プラスミドが滅菌milliQ水に溶けているもの（TEは入っていない）：50マイクロリットル EcoR1とXho1用の10×buffer：10マイクロリットル 制限酵素EcoR1：5マイクロリットル 制限酵素Xho1：5マイクロリットル 滅菌milliQ水：30マイクロリットル 合計：100マイクロリットル
- fuyu2005
- お礼率8% (1/12)
- 生物学
- 回答数1
- ありがとう数1
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
それであっていますよ。 ただ制限酵素が全体の10％というのは少し多い気がします。 ちょっとうるおぼえなのですが 溶液の10％が上限（多いとスター活性がでやすい）という話を聞いたことがあるので 酵素の割合を少し減らして反応時間を少し伸したほうがいいかもしれません。
関連するQ&A
- ライゲーション、形質転換がうまくいきません
以前1629941で制限酵素処理について質問させていただいたものです。その後 約3kbpのpBluescript II sk (+)のmcsをEcoR1,Xho1で切断し、EcoR1,Xho1で切断した約1.6 kbp「プロモーター＋ネオマイシン耐性遺伝子＋polyA」断片を挿入したいのですが、全くコロニーができません。（LB培地＋Ampにて）（ベクター、インサートともにゲル抜きしその後フェノール抽出した） ライゲーションの系はSDW：4.4マイクロリットル 10×T4buffer：1マイクロリットル 10ｍMdATP：１マイクロリットル インサート（190ナノグラム/マイクロリットル）：1.6マイクロリットル ベクター（182ナノグラム/マイクロリットル）：1マイクロリットル T4リガーゼ：1マイクロリットル もうひとつの系はインサート2マイクロリットル（SDWは4マイクロリットル） 16℃で14時間 そのライゲーション産物10マイクロリットルを100マイクロリットルのコンピテントセルに入れました。 pBluescript II sk (+)をコンピテントセルに入れる技術はあります。 制限酵素処理後、形質転換までに他にすべき操作があるのか? 根本的にどこか間違っているのか? やり直すとしたらどこからやり直すべきなのか? 教えてください。 今回使用した酵素、buffer全て新しく購入したものです。 よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- 制限酵素によるプラスミドの切断
生物学の実験で、制限酵素によるプラスミドの切断の実験を行いました。制限酵素で二重鎖DNAを切断し、生じたDNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離するという方法です。 コントロール・・・・（プラスミド 蒸留水 High Salt Buffer Medium Salt Buffer) サンプル・・・（コントロールにEcoRI HindIIIの制限酵素を加えたもの）の２つをそれぞれをゲルに流し込み。電気泳動を行いました。 電気泳動後、ゲルの写真を見たのですが C ｜ ｜ S ｜｜｜ － →泳動方向→ ＋ というような結果が出ました。 サンプルとコントロールのバンドの距離が同じ長さなので、切断されていないと先生が言いました。ここから質問なのですが、 切断されていないということは、サンプルのレーンのバンドの数は０本ということですか？ また、なぜ切断されなかったのか教えてください（制限酵素によってDNAが切断されたのなら、そのDNAにはその制限酵素の認識配列が含まれいたということですよね。私たちの班のDNAには認識配列が含まれていなかったことになるのでしょうか？）
- 締切済み
- 生物学
- 制限酵素地図の作成
3.2kbのプラスミドの制限酵素部位AおよびEに、制限酵素AおよびEで切断した1.8kbのDNA断片を挿入したものがプラスミドXである。プラスミドXを制限酵素A、B,、CおよびDのうちの2種類を用いて切断したときに生じるDNA断片のサイズは下のようになった。 プラスミドXの制限酵素地図を作成せよ。 またすべての制限酵素切断部位間の長さ(kb)も示せ。 ただし、制限酵素A、B、C、DおよびEは挿入DNA断片をそれぞれ1ヶ所だけ切断し、それぞれ制限酵素の組み合わせでプラスミドXを切断すると、下に示した2つの断片のみが生じるものとする。 AとBを用いると、4.5と0.5の断片が生じた。 AとDを用いると、3.4と1.6の断片が生じた。 BとCを用いると、4.8と0.2の断片が生じた。 BとDを用いると、3.9と1.1の断片が生じた。 作成の仕方を教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
- 制限酵素のバッファーについて
制限酵素でPCRしたDNA配列をinsertとしてvectorに入れようとおもっています。 その際に2種類の制限酵素で切断しようと思っています。組み合わせはSapIとHindIII、SalIとHindIIIです。これらで同時に切断したいので、これらに適したBufferを教えて頂けると幸いです。 また、制限酵素二つで切断する際のバッファーの選び方があれば教えて頂きたく思います。 よろしくお願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- プラスミドの制限酵素処理
プラスミドを作る時、制限酵素で切断しますよね。切断したサンプルは電気泳動をして、目的のサイズの部分のゲルを切り出して精製して、ライゲーションするわけですが、セルフクローニングがたくさん出てしまい、なかなかうまくいきません。 ２種類の酵素で処理（切断部位が近接（数～数十bp））していて、脱リン酸化処理はしていません。２カ所で切断されていれば、脱リン酸化にかかわらず、セルフライゲーションは起こらないはずだと思うので。 だとすると、どちらか一方の酵素でしか切断されていないものが多いことが原因だと思います。１カ所切断と２カ所切断のサイズが同じぐらいであるため、分離するのは難しいと思うのですが、何かよい方法、アドバイスはありませんでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- 制限酵素のユニット計算について
・１U＝１μｇ;のλDNA(48000bp)を一時間に完全分解する酵素量 ・λDNAはEcoR1で5か所切断できる を前提に pbluescript(3000bp)１μｇ分をEcoR1で一か所切るのに必要な酵素量は？という問いに対する答えが （48000/3000）×（1/5）＝3U となっていますが、、なぜ48000を3000で割るのでしょうか？ 通常の比の式で考えると3000／48000になるのでは？？ 勉強不足ですみません；調べてもよくわからなかったのでどなたか解説していただきたいです。
- 締切済み
- 生物学
- 今度は・・制限酵素の失活についてなんですが。。。
毎回毎回すみません・・また実験がうまくいきませんでした・・・ プラスミドＤＮＡをEcoRI,BamHIの二種類の制限酵素を使用し、どのように切断されるかをアガロース電気泳動を行って、バンドの移動度を比べてみました。 １つは、EcoRIだけで切断し、もう１つは二種類の酵素で切断しました。 でも電気泳動ででたバンドはネガコンとして流した未処理プラスミドＤＮＡと同じバンドでした。通常移動度が遅くなったり、バンドが２本でるはずなのですが・・まったくありませんでした・・・ 制限酵素が失活して、切断できなかったのではないかと考察したのですが・・・酵素は熱を加えると失活してしまうため温めないように注意したのですが・・ 制限酵素が失活してしまう要因をどうか教えてください。実験で注意すべき点など教えていただければ今後の実験に役立ちます。ぜひ実験をして経験された事でもよいので教えてください。いつもいつも実験の失敗についてばかり質問してしまってすみません・・・ よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 制限酵素地図の作成方法(すみません。急いでおります)
長さ5のある環状プラスミドを三種類の制限酵素(pst1・hae2・eco1)で切断したときの切断部位の求め方が分かりません。 三つの断片長とそのうちの二つずつ組み合わせたときの断片長は提示されています。(pst1+hae2の断片長は0.9/2.0/2.1のような感じです) また、pst1によって0が切れ、hae2によって0.9が切断されていることも分かっています。 環状プラスミドを一直線状に表して切断されるところの座標を制限酵素２種類での組み合わせで当てはめていっているのですが、それを三つ書いた後、最後に三つの図を組み合わせる方法がどうもよく分かりません。 パズルみたいなものだと聞いたのですが、どうか小生にもわかるように教えてください。 あと、できれば今晩中に教えていただければと思います。 手前勝手ですが、よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 制限酵素地図の作製について
初質問です。よろしくお願いします。 プラスミドＤＮＡを５種類の制限酵素で切断し、電気泳動させて、制限酵素地図を作ろうと思ったのですが、 計算してもＤＮＡサイズの合計が全然違います。 （例えば、Hind3で切ったときは、7.6、5.8、0.5(×10^3)、Hind3+BamHIで切ったときは、5.8、3.6、1.1、0.46(×10^3)という具合です。） この場合はどのように処理すればよいのか教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
ありがとうございます。うまくいきました。