- ベストアンサー
oligo dT カラム の再使用について 教えてください
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
貧乏なラボにいたので、目標10回、最低でも5回は再生して使い回したものです。だいたいは、Oligo-dTの結合能がおちるより、不純物が蓄積して流速がおちるのが原因で引退します（それでも、いざというときのためにとっておくのですけど）。 ただ、cDNAライブラリーの作製や、RT-PCRに使うときはお勧めしません。わたしは、主にNorthern用のサンプル調製用にしていました。 カラムを再生するときは、0.1N NaOHを2 bed-vol、次に純水を10 bed-vol （流出液をpHペーパーではかり、中性付近になるまで）ほど通して、最後に、Elution bufferかHigh Salt Bufferにでも置換して保存します。防腐剤としてアジ化ナトリウム（0.02 %ほど）をいれるといいでしょう。
関連するQ&A
- oligo(dT)-celluloseによるmRNA精製法
oligo(dT)-celluloseによるmRNA精製を行いました。 Bufferとして 1) 10mM Tris-HCl - 1mM EDTA - 0.5M NaCl 2) 10mM Tris-HCl - 1mM EDTA - 0.1M NaCl 3) TE Buffer (10mM Tris-HCl - 1mM EDTA) を使いました。 1,2のBufferを使うことによって何故rRNAとtRNAを濾液として抽出されるのか。また、TE Buffer(70℃)にはRNAsecureが含まれているのですが、それによって何故oligo(dT)-celluloseとの水素結合が切れて抽出されるのかが分かりません。 知識を恵んでください。お願いします。
- 締切済み
- 生物学
- カラムについての質問です
タンパク質初心者です。 とてもくだらない質問なのかもしれませんが、教えてください。 Hi Trap Q Hi Trap SP の違いは何ですか？ ２つを使い分けるとき、判断するポイントはどこですか？ 実際に精製を行うときに、どのように実験を組み立てていくのですか？ どのような精製を行うかによって違うと思いますが、たとえばHis-tag の場合、どの辺に注目して使用するカラムやbufferを決めているのか、 教えてください。 よろしくお願いします。
- 締切済み
- 化学
- 抗体カラムの防腐対策を教えてください
あるタンパクを精製するために、そのタンパクに対する抗体を固定化したゲルを作り、カラムに詰めました。このタンパクを発現させた動物細胞の培養上清をこのカラムにロードして精製するのですが、一回でもロードすると、その後の４℃での保存中にカラム内でバクテリアが湧くと見えて、２回目以降の精製タンパクに高いエンドトキシンが検出されます。４℃での保存中にカラム内でバクテリアが湧くのを防ぐいい方法を教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
- 抗体カラムについて…
抗体カラムを作製して，それを用いてタンパク質の精製を行っているのですが，カラム作製後，1，2回の精製では目的のタンパクを分離できたのですが，その後はカラム自体に吸着せずフルスルーに出てきてしまいます．抗体カラムがへたったりすることはよくあることなのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- RT-PCRについて
抽出したRNAからRT-PCRでｃDNAを作成する際に、原核生物の場合はoligoーｄT primerはpoli(A)-tail が存在しないので、利用できないと書いてあったのですが、実際手違いで利用したところなぜかｍRNAを取り出すことができました。これはもしかしたらpoli(A)-tailが存在するかもしれないということなのでしょうか？ この理由について知りたいのですが、回答よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- PD-10カラムを用いた抗体精製法
マウス腹水での抗体大量調製の実験をおこなっています。マウス腹水から抗体を取り出し、硫安分画し、PD-10カラムで抗体を精製したいのですが、PD-10カラムにのせるサンプル量に限界があるのでしょうか?研究室のプロトコールでは、硫安分画した腹水液を3.5mlに合わせてカラムにのせると書いてあるのですが、腹水液を何回かに分けて全量のせた後に溶出する方法は駄目なのでしょうか?
- 締切済み
- 生物学
- 現在マウスの胚盤胞からtotal RNAの精製→定量実験を行っています
現在マウスの胚盤胞からtotal RNAの精製→定量実験を行っています。 最終的にはマイクロアレイにかける予定です。 （数十個～100個近く集めるので、例えばsingle-cellを増幅するような特別な方法はとりません。） その定量が、今うまくいっておりません。 blastocyst 1個＝2 ngだそうなので、30個＝60 ngとして精製していますが、 微量専用の電気泳動で定量すると、数ngと出てしまいます。 brain total RNA60ngをcontolとして同様の処理を行うと、そちらは多少のロスがあるものの、 リーズナブルな量が定量できます。胚になるとどうもダメなようです。 リアルタイムPCRしても、やはり狙ったサイクル数より多くなってしまいました。 マウス胚は、IVFした後胚盤胞まで培養し、少量の培養液と共にエッペンチューブに移し、 すぐにTrizol 200ulを足してよくピペッティング→-80℃保存、という形で回収しています。 いつも培地からそのままエッペンに移しているので、 回収時にmineral oilが含まれているとダメかと思い、brainのサンプルをwith oilバージョンで 試したのですが、non-oil バージョンと収率は変わりませんでした。 哺乳類の胚あるいは卵からtotal RNAを精製し、定量したことのある方、 ご存知のことがあれば教えて頂ければと思います。 よろしくお願い致します。
- 締切済み
- 生物学
- RNAの温度安定性
total RNAを組織から抽出し、RNase-free水に溶解し、-80度で保存しています。今後、このRNAを使って実験をしようと思っているのですが、、、RNAがどれくらい温度に対して安定なのか心配しています。というのも、今後、実験のたびにRNAを冷凍庫から取り出し、必要な分量を分抽した後、再び冷凍庫へ返すといったことを繰り返すからです。RNAにお詳しい方がいらっしゃいましたら、（１）RNAの熱安定性について（２）一般的なRNAの保存法とその注意点（３）冷凍→分抽→冷凍の繰り返し作業についての意見およびより良い方法、の３点について教えていただけないでしょうか？よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- 酵素精製のゲル選択について
ペクチナーゼを精製するために、 DEAE-Toyopearlを使い、 フラクション分画を行いました。 pH7.0の燐酸bufferを流し、 NaClで勾配を付けて溶出させたところ、 分子量60Da付近のタンパクが3種出てきました。 この後、これらをどう分けるべきか悩んでいます。 分子量が近いため、分子量分画はダメでしょう。 DEAEの後のCMカラムは逆に出るだけだから ダメだとの指摘があったので、これもイマイチ。 何か良い手はないでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- RNAスプライシングの問題
RNA splicing is an essential, precisely regulated process that occurs after gene transcription and before mRNA translation. A gene is first transcribed into a pre-mRNA, which is a copy of the genomic DNA containing intronic regions destined to be removed during pre-mRNA processing (RNA splicing), as well as exonic sequences that are retained within the mature mRNA. The splicing of pre-mRNA occurs in multicomponent molecular machines called spliceosomes, in which the two-step splicing reaction comprising intron removal and exon ligation takes place. To enable splicing to occur correctly, the positions of the exon–intron boundaries are marked by short consensus sequences. There are less clearly defined sequences within the exons and the introns that positively or negatively regulate splicing (referred to as enhancer or repressor sequences). As observed for transcriptional control, RNA splicing is subject to extensive regulation by signalling pathways. During splicing, exons can either be retained in the mature message or targeted for removal in different combinations to create a diverse array of mRNAs from a single pre-mRNA, a process referred to as alternative RNA splicing. This process occurs in several ways including the skipping of entire exons, the inclusion of alternative exons, the use of different splice sites and/or the retention of introns. Alternative splice events that affect the protein coding region of the RNA might give rise to proteins that differ in their sequence and therefore in their activities. Alternative splicing within the non-coding regions of the RNA can result in changes in regulatory elements, such as translation enhancers or RNA stability domains, which might have a dramatic effect on the level of protein expression . Alternative RNA splicing is controlled by a large number of factors but the SR protein family, together with hnRNP A/B proteins, are key regulatory components. Given that as many as 60% of all human genes are alternatively spliced, the potential impact of alternative splicing on both drug efficacy and toxicity is high, because of the large number of genes involved in drug response pathways. というRNAスプライシングの概略を説明した文章を読んで問に答える問題です (1)RNAスプライシングを上の文章に沿って２００字で説明せよ (2)RNAスプライシング反応は２つのフェーズに分かれるどのような反応か本文にそって１００字以内で説明せよ (3)RNAスプライシングのための必須塩基配列側の条件に付いて本文に記載されているものを日本語で列挙せよ (4)選択的RNAスプライシングはどのようなものか１５０字で説明せよ (5)Given that as many as 60% of all human genes are alternatively spliced, the potential impact of alternative splicing on both drug efficacy and toxicity is high, because of the large number of genes involved in drug response pathways. を１５０字以内で日本語訳せよ とありました。 (1)はRNAスプライシングとは遺伝子転写後からmRNA翻訳前の間に生じるRNAの正確な制御機構である。初めにpre-mRNA中に遺伝子が転写される。そしてこの中に含まれるイントロンと呼ばれる領域がスプライシングの際に除去され、成熟mRNA中に維持されるエクソン領域が保存される。Pre-mRNAのスプライシングはスプライソソームと呼ばれる複合体によって行われ、二段階の反応によってスプライシングは行われる。 としましたがこの文章量からして自分の解答は物足りないと感じましたがどこまで書けばいいのか混乱してしまいました。 (2)は二段階のステップ １イントロン除去 ２エクソン核酸連結なのはわかりますが１５０字の説明がまとまりません。 (3)はショートコンセンサス配列 (4)選択的スプライシングとは単一pre-mRNAからmRNAの多様性のある配列を作成するための組み合わせにおいて、各エクソンにおいて成熟RNA中に残すかあるいは除去をするかのいずれかが行われる過程である。としましたがこれも非コーディング領域の話などをおざなりにして物足りない説明だと思いました。 そして一番の難問は(5)です。 この手の問題はいつもそうですが確実に直訳をしたら１５０字など到底届かない気がします。 (5)は 人の全遺伝子の６０%が与えられた結果と同様に選択的スプライシングを受け、選択的スプライシングの薬品効果と毒性における潜在的な影響は高い。なぜなら薬品反応伝達経路に関係する遺伝子群のほとんどをこの含んでいるためである。 と１０８字しかありません。どうすればいいのでしょうか。恐らくGivenのところをもう少し修飾しなければならないのだと思いますがそうすると余計なことまで書いてしまいそうで不安です。けれども１５０字といわれているので確実に減点対象だと思います。 適切なアドバイスお願い申し上げます。 こういった問題が沢山英語では出てくるのですが 上手く日本語にまとめられませんでした。お時間がございましたら是非ご教授お願い申し上げます。
- ベストアンサー
- 英語
