• 締切済み

免疫染色の方法について

otxの回答

  • otx
  • ベストアンサー率44% (256/576)
回答No.3

あと、マウスの組織をマウスの抗体で染めるというのは危険名のことなので、ニチレイのを参考にされてください。 http://www.nichirei.co.jp/bio/technical/protocol/meneki2/histatm/theory.html

関連するQ&A

  • 二重染色プロトコル

    ある2つの細胞の共培養系を、 1次抗体:anti α-actinin(sarcomeric)mouse、anti vimentin rabbit 2次抗体:Alexa 532 goat anti-mouse IgG、Alexa 488 goat anti-rabbit IgG にて蛍光二重染色しようと思います。 その際のプロトコルなのですが、 固定処理後→PBS→ブロッキング→1次抗体(actinin)→PBS→2次抗体(Alexa532)→PBS→1次抗体(vimentin)→PBS→2次抗体(Alexa488)のように1つずつ付加していかなければならないでしょうか。 1次抗体同士、同様に2次抗体同士を同時に付加してはダメでしょうか。くっつく部分は異なるのだから、同時に付加しても問題ないのではと思ってしまうのですが、甘いでしょうか。 よろしくお願いいたします。

  • 免疫組織染色とDAPI について

     現在、核に局在すると推定しているタンパク質について免疫組織染色解析を行なっています。そこで、あわよくば細胞内局在まで見てやろうと思い、発色後の組織をDAPIで染色して観察しているのですが、どうも免疫染色のシグナルが強い切片ほどDAPIの蛍光が弱いのです。(DAPIは、ネガコンのpreabsorbedで最も良く染まり、次に抗体希釈条件によって免疫染色シグナルが弱いものが染まりやすいです。強く発色させたものでは、前二者で染まっていた細胞でも全くDAPI蛍光が観察できなかったりします。)  そこで、質問なのですが、核にあるタンパク質に結合した一次・二次抗体および標識タンパク質や発色物質によってDAPIの浸透が阻害されるようなことはありえるのでしょうか?  必要そうな諸条件を以下に書きます。 ・ブロッキング:10%(w/v) BlockAce, 10%(v/v)ヤギ正常血清 in PBS ・一次抗体希釈液:0.3% PBS-BSAまたはCan get signal solutionA(TOYOBO) ・二次抗体:ビオチン化抗ウサギIgGヤギ抗体 ・ABCキット:VECTASTAIN Elite ・発色試薬:DAB(Niは使用しない) ・DAPI染色:1 ug/mlで5 min(遮光) ・封入:余分なDAPI溶液を軽く除いてから、水溶性封入剤VectaMount AQ (VECTOR)、 ・遮光して乾燥後観察

  • 培養細胞の核での免疫染色

    はじめまして。いつも参考にさせて頂いてます。 培養細胞での免疫染色で困っているので伺いたいのですが、現在核内の転写因子に対する抗体を用いて、培養細胞で免疫染色を行っています。 しかし、なかなかきれいに染まらず(核のシグナルが弱く、細胞質がぺたーと染まってしまう)困っています。 抗体は、マウスの組織を用いてきちんとワークしている(核がきちんと 染まっている)事を確認し、その細胞で目的の遺伝子が発現している事はリアルタイムRT-PCRで確認しています。 プロトコルとしては、 スライドガラスに細胞を貼付ける→4%PFAで固定(4℃、20分)→0.1% TritonX100で可溶化(4℃、15分) →3%BSAでブロッキング→1次抗体(4℃、O/N)→2次抗体(RT,1h)→ヘキストで核染色 各ステップ間にPBSで3回Washを行っています。 細胞質が染まる事は2次抗体のバックではない事は確認しました。 何か些細な事でも構いませんので、何か注意点等ありましたら、よろしくお願い致します。

  • 抗体 交差性

    以前にも似たような質問が投稿されていましたが、よく理解できなかったので質問させていただきます。 免疫染色かFACSを考えているのですが、anti-A(免疫動物rabbit、交差性mouse,rat,human)で染めて、見たいと思っています。 (1)controlはcontrol rabbit IgGでいいのか? (2)それをFITC anti rabbit IgGでそめればいいのか? (3)さらにPEもしくはPECy7などで別のを染める時はクロスは何を考慮すればいいのか? anti rabbit IgGのクロスしっかり調べてやりなさいと言われましたがいまいち分かりません。よろしくお願いします。

  • Western blotting について

    ラット大腸粘膜をスクレイプしたサンプルを用いてWestern blottingを行っています。 現在、β-catenin (Cell signaling #9562 Rabbit poly)の検出をトライしているのですが、Positive controlのβ-actin(SIGMA Mouse mono)は発光30秒でしっかりバンドが確認できますが、肝心のβ-cateninは10分発光しても全くバンドが出現しません。 ウェルに注入するサンプルはタンパク量10μgで10μl前後です。 ブロッキングは5%スキムミルクで一晩、 1次抗体は添書通りの1;1000の希釈で室温60分、 β-cateninの2次抗体にはABR社のDonkey Anti Rabbit HRPを用いて、添書では1:2500の希釈を1:1500で室温60分反応させています。 発光にはECLを用いてLAS-1000 plusで撮影しています。 Western blottingの経験がほとんどないため、どこから改善していくべきか教えてください。 メンブレンは冷凍保存しています。

  • 免疫染色について教えてください。

    仕事で免疫染色をしていますが、原理などまったくわからないままやっています。 自分で理解したくて、いろいろ本を読んでみますが、そこでも基本的な知識がないため 難しいです。 せっかく染色するなら自分で判断できるようになりたいです。 どなたか、適切なアドバイスをお願いします。 書籍やサイト等勉強できるものがあれば教えてください。 LSAB法で、PCNA,GST-P,を染めたり、T細胞B細胞も染めた事もあります。

  • 免疫染色

    神経細胞をギャ場トランスポーターやグルタミン酸トランスポーター抗体で免疫染色すると神経細胞の細胞体も染まるのはなぜでしょうか? トランスポーターはシナプス部位に存在するのでシナプスだけが染まるように思えるのですが。

  • 免疫染色について

    免疫染色を行い、図のような結果が出たとします。 左はコントロールで、右は調べたいことで、この実験はレンチウイルスにEphB2とGFPとshRNAを導入して、EphB2の発現を抑制されるのかという実験です。 ここでこの結果の見方が分からないのですが、GFPで蛍光を見ているのに真ん中の図には赤色の蛍光があります。 これはどういう意味なのでしょうか? 原理自体よく分かっていないのでこのような質問となってしまいましたが、分かる方よろしくお願いします。

  • 免疫染色について

    私はBrdUとマーカーの二重染色をしています。 その際、クエン酸スチーム法いうやり方で、抗原ふかつしているのですが、なぜクエン酸スチーム法がいいのか、利点が分かりません。 分かる方いらっしゃいましたら、教えてください(*_*)

  • 免疫染色

    パラフィン切片で、間接法とペルオキシダーゼを用いた免疫染色をしています。一次抗体、ビオチン標識二次抗体そしてHRP-ストレプトアビジンは、反応処理後回収して数回利用できると聞いたのですが、本当でしょうか?もし、一次抗体のタイプが異なる場合、例えばマウスIgMで用いたHRPは回収後、ラットIgGの際に使って大丈夫ですか?さらにもう一つ質問、DABは要時作製とプロトコール本には書いてありますが、保存できる方法もあると聞きました。 たくさん質問しましたが、よろしくお願い致します。