ゲルにかかる圧力

質問

ゲル濾過をしようとアマシャムの1×30cm（耐圧0.1MPa)に
Sephadex70を充てんしました。アマシャムのHPLC装置(AKTAFLPC)に接続し、bufferを0.5 ml/minの速度で流したのですが、カラムの限界圧力を超える0.3MPaかかってしまう状態です。0.01ml/minに下げれば、耐圧程度に抑えることが出来るのですが、これだともの凄く時間がかかっていしまいます。
Sephadex 70ってこんなに、超低速で分離しなければならないものでしょうか？
それとも、ゲルの充てんなどがまずかったのでしょうか？
誰か、詳しい方教えて下さい。

回答No.1

mizu_atsu · ベストアンサー

AKTAシステムは使っていました。
ゲルろ過もやったことがあります。
但し、市販のカラムでゲルもSuperdexですが。

もう結構前にやったことなので細かいことは覚えいてませんが
1×30程度のカラムで1時間半位だったと思います。
（一日で準備、分析、洗浄が楽勝でできるくらいですから）
0.01ml/minでは分析だけで50時間もかかってしまいますね。
そんなに遅くはないはずです。
それだと自然落下のゲルろ過より遅い気が・・・
AKTAは高速クロマトグラフィーなのですからもっと速いです。

圧力が上がる原因としてはいろいろありますが
・試料に不純物（不溶物）が多い→試料を遠心して上澄みを使う。
　ただのバッファーを流して圧力が高い場合はこれが原因ではないと思いますが。
・ラインのフィルターが汚れている。
　本体のフタを開けたところのラインの途中に直径5mm位のフィルターがついています。
　これが意外に詰まりやすい。
　交換するか超音波ででも洗浄してみてください。
　マニュアル（英語）には週1で交換と書いてあった気がします。
　さすがにそこまでの頻度では変えませんでしたが割と早く交換してました。
　確か1個2,000円と小さいくせに高価だった気がします。

お礼

丁寧な返答有り難うございます。
不純物の除去は行っていますので、ラインのフィルターが
汚れている可能性が高いかもしれません。
メンテナンスやってみます。

回答No.3

mizu_atsu

もう一個思い出しました。

基本的なことで申し訳ないが
バッファーはろ過していますか？
使う前には相当細かい（ポアサイズは失念）濾紙でろ過＆脱気が必要です。

私に思いつくのこれくらいですね。
では頑張ってください。

お礼

脱気はしましたが、濾過はしていませんでした。
また、サンプルは流さず、bufferによるカラムの平衡化で
このように圧が上がるので、bufferか先のラインのフィルター
の汚れかもしれません。
何度も、有り難うございました。
連休明けにでも、チャレンジしたいと思います。

回答No.2

mizu_atsu

少し思い出したことがあるので追記します。

他に圧力が上がる要因として
・保存用のエタノール溶液（20％）が残っているときは高い
　保存液から水への置換時の流速は半分くらいにした気がします。
　でも質問ではすでにバッファーなのでこれは違いますね。
・サンプルの量が多すぎる
　サンプルを注入すると多少なりとも圧力が高まります。
　イオン交換などは多少（たんぱく質として）多量であってもそこそこの速度で流せますが
　ゲルろ過だと許容タンパク量も液量も大変少ないです。
　1×30だとたしか200マイクロリットルが液量として最大（タンパクの量は失念）
　だった気がします。
　もしかするとタンパクの量が多すぎるのかもしれません。
　試料がタンパクでない場合は関係ないかもしれませんが溶質が多すぎるのかもしれません。