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ウエスタンブロットでのフィルム感光について

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お礼率 33% (2/6)

ウエスタンブロットを行い、メンブレンに転写し、ブロッキングしたあと、
フィルムに感光してバンドを確認してるのですが、その際、バックグラウンドが
濃くなり、バンドがきれいに見えません。何かいい方法はないでしょうか。
メンブレンのメーカーや種類が関係してるのでしょうか?メンブレンはニトロセルロースで、アドバンテックを使用してます。
よろしくお願いします。
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質問者が選んだベストアンサー

  • 回答No.2

いくつかあげてみますので興味があれば試してください。
バックが高くて真っ黒になってしまうのですよね?

1.ブロッキングの濃度を上げる。
2.2次抗体の濃度を減らす。
3.2次抗体の反応時間を短く。
4.1次抗体を4度でオーバーナイト。
5.高いけど一部のモノクロで売られているHRPつきのものを使う。
6.ウォッシュの回数と液量を増やす。
7.2次抗体の前にもう一度ブロッキングを入れる。
8.ECL+つかっているならECLに変える。感度は下がるが見えるものは見える。

まだまだありそうですがとりあえず。
実用的なものから、そんなに効果が望めないものまであります。
順番は関係ないです。

2,3,5,8あたりは試しても良いかもしれません。

個人的にはPVDFよりニトロセルロースでバックが少ない気がします。
クルードサンプル、免沈サンプルだとどうしても汚くなります。
検出限界まで量を減らしてバックを減らすこともありますがというていど。

研究にさわりのない程度の情報を書いてくだされもう少し絞れるかもしれません。
補足コメント
kote2

お礼率 33% (2/6)

ブロッキングの濃度は、5%スキムミルク
2次抗体は1000倍で、室温1時間インキュベートしてます。
ウオッシュはPBSで10min3回程度です。
初歩的な質問かもしれませんが、ECLとは何ですか?
投稿日時 - 2001-10-18 19:16:14
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その他の回答 (全3件)

  • 回答No.1
レベル6

ベストアンサー率 0% (0/1)

今はニトロセルロースより、PVDF膜が一般的なのではないでしょうか。 ニトロセルロースの使用経験はありませんが、 バックが高く、膜の強度が弱いということを聞いたことがあります。 バンドの出るべき高さはわかっているのでしょうか? もし、メインの出るべきバンドがあるなら、 露光時間の調整だけで対処できる可能性はあると思います。 もう少し情報(状況)を追加してください。 ...続きを読む
今はニトロセルロースより、PVDF膜が一般的なのではないでしょうか。
ニトロセルロースの使用経験はありませんが、
バックが高く、膜の強度が弱いということを聞いたことがあります。
バンドの出るべき高さはわかっているのでしょうか?
もし、メインの出るべきバンドがあるなら、
露光時間の調整だけで対処できる可能性はあると思います。
もう少し情報(状況)を追加してください。
補足コメント
kote2

お礼率 33% (2/6)

ブロッキングの濃度は、5%スキムミルク
2次抗体は1000倍で、室温1時間インキュベートしてます。
ウオッシュはPBSで10min3回程度です。
認識バンドは30kD付近です。
投稿日時 - 2001-10-18 19:23:03


  • 回答No.3

ECLについては参考ページを参照してください。 WashにTween 20は入れてないのですか? 私はファイナル0.05%で入れてます。 TBSを使っていますが変わらないと思います。 参考ページにいろいろいろありますのでそちらも参考に。 経験ですが、メンブレンをあとで染色してみて、レーンが 塗りつぶされているほどタンパクをのせているとどうしても 黒くなります。検出できるならばタン ...続きを読む
ECLについては参考ページを参照してください。

WashにTween 20は入れてないのですか?
私はファイナル0.05%で入れてます。
TBSを使っていますが変わらないと思います。

参考ページにいろいろいろありますのでそちらも参考に。

経験ですが、メンブレンをあとで染色してみて、レーンが
塗りつぶされているほどタンパクをのせているとどうしても
黒くなります。検出できるならばタンパクを減らすことでバックは落とせます。
バンドがラダーに見えているぐらいまでならほとんどバックなしです。
長焼きすると黒くなりますけどね。

何かありましたらまたどうぞ。
お礼コメント
kote2

お礼率 33% (2/6)

いろいろありがとうございました。
早速、やってみます。
メンブレンを染色するのはいい方法ですね。
また、他の実験もしてるので何かありましたら
聞くと思います。
ありがとうございました。
投稿日時 - 2001-10-19 22:15:27
  • 回答No.4

まだ回答を締め切っていないので補足です。 メンブレン染めるときは、NCならCBBはだめですよ。 溶けます。たまにやっちゃう人がいます。 ポンソーSで染めましょう。長期保存にはCBBがよいです。 PVDFなら大丈夫。 私はうまくいかなかったときのチェックのために ゲルも残しておいておかしいときは染めます。 メンブレンも明らかな時以外は染めるようにしています。 (手間でないから ...続きを読む
まだ回答を締め切っていないので補足です。

メンブレン染めるときは、NCならCBBはだめですよ。
溶けます。たまにやっちゃう人がいます。

ポンソーSで染めましょう。長期保存にはCBBがよいです。
PVDFなら大丈夫。

私はうまくいかなかったときのチェックのために
ゲルも残しておいておかしいときは染めます。

メンブレンも明らかな時以外は染めるようにしています。
(手間でないから)

できるだけ原因は詰められるようにしておきましょう。

あと回答も適当なところで締めてね。
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