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PCRについて
Drgorillaの回答
DpnIというのはメチル化されたDNAを切断する酵素です。 なので、プラスミドをPCRで増幅後DpnIで切ると、大腸菌内で増やしてDNAがメチル化されているプラスミドDNAはずたずたに切れてしまいますが、PCRで増やしたDNAは切れません。 プラスミドが残っていると、その後、形質転換した後、元のプラスミドばかり取れてくるのでこのような処理をします。
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電気泳動について質問です。3種類のプラスミドDNAについて、同じプライマーを用いてPCRを行いました。このバンドを電気泳動してみたところ、2種類のプラスミドDNAに関してはクッキリと目的バン ドが出たのですが、残り1種類のプラスミドDNAの増幅産物にかんしては、薄い目的バンド➕スメアが観察されました。この原因として考えられるのは何でしょうか？自分が考えているのは、プライマーや酵素には問題がないと思うので(他2種類のプラスミドDNAのPCRはうまくいった。)、テンプレートのプラスミドDNAの精製度が低いと考えています。現にO.D値も1.72くらいだったので…。なので、プラスミドDNAの抽出からやり直そうかと考えています。 他に何か考えるべき要因があれば、ご教授お願いします！
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こんにちは。インビトロジェンのpENTR/D-TOPOクローニングキットを使って実験しているものです。 Gatewayのエントリーベクターを作成すべく、pENTR/D-TOPOに2kbpのDNA フラグメント（PCR産物）を入れることを試みました。しかし、遺伝子を大腸菌にトランスフォームした後、出てきたコロニー30個を楊枝でつついてコロニーPCRをかけたところ、期待していたインサートのバンドが全く検出されませんでした。 がっかりしましたが、念のために同じ大腸菌を培養してそこからプラスミドを精製し、PCRをかけてみたところ、実はなんと2kbpフラグメントはかなり高い確率でpENTR/Dに入っていたのです。pENTRを使うとこの現象が必ず起き、困っています。 ちなみに、大腸菌DH5α、ベクターpGEM-Teasyの組み合わせで使用したときには、このような現象は起きませんでした。コロニーPCRはKOD',最初に９５度５分で処理しています。 精製したプラスミドではPCRはうまくいったのに、なぜコロニーPCRではダメだったのでしょうか？このような事を経験された方はいませんか？それはどのように改善されましたか？コロニーPCRができないと沢山のプラスミドを精製しなくてはいけないので不便しています。
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定量RT-PCRのスタンダードについて 抽出したプラスミドの濃度からコピー数を算出し、定量RT-PCRのスタンダードに用いています。 ただ濃度の測定したときの吸光度が低いので、測定誤差の影響が大きいように感じています（測定に用いている分光光度計は70μlキュベットしかなく、サンプルを10倍に希釈して測定しています）。 そこでプラスミドをM13プライマーでPCRをかけて、増幅産物をスタンダードに利用しようと思っています。 このような場合、何か注意点はありますでしょうか？ やはり増幅産物の精製は必要でしょうか？ またグリセロールストックの大腸菌に直接PCRをかけてスタンダードに用いるのは強引でしょうか？ ご意見、アドバイスを頂けると助かります。
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お礼
そういうことでしたか！よく分かりました！！ありがとうございます。