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TA-クローニング法について
sewingcoughの回答
TAクローニングの一番のメリットは 制限酵素処理を行う必要が無い点にあります。 プライマーに制限酵素サイトがあろうがなかろうが PCR産物をそのままベクターに挿入することが可能です。 なおかつ、制限酵素処理済みのpGEMベクターなどを購入すれば ベクター側も制限酵素処理する必要が無いので、 PCR->PCR産物のクリーンナップ->ライゲーション の３ステップのみで多くの時間を節約できます。 といっても、実際は制限酵素処理など大した手間ではないので 多くの場合はTAクローニングを行いません。 じゃあ、どういった場合にTAクローニングを行うのか？ 大抵の場合は、制限酵素サイトが邪魔な場合だと思います。 例えばプロテアーゼ処理後にN末端に余計な配列を入れたくない と思ってFactorXaを使用したとしても、例えばpGEX-5Xを使えば 必ずBamHI由来のグリシン-イソロイシンの2つがN末端に入ります。 しかしここでタグとの間にFactorXa配列を持つTベクターを使えば 制限酵素サイト由来のアミノ酸残基がN末端に入ることはありません。 他にも制限酵素を使う際に問題になることはいくつかありますが、 こんな感じで、制限酵素を使えないなにかしらの理由があるとき TAクローニングを使うことが多いと思います。 ・・・といいつつ、TAクローニングを好んで使う人も結構います。 どうも、様々なタンパク質それぞれ様々なベクターに乗せることを 考えると、そのためにいちいちプライマーを設計するのは大変なので 予めベクターの方をTA向けにいろんなものを設計しておくようです。 それならタンパクの方は一組のプライマーでどれにでも乗せられるので。 まあ、わたしの場合はそこまで厳ついDNAワークをすることはないので あまりTAクローニングのお世話になろうという気にはなりませんが・・・
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