- 締切済み
トランスフォーメーション
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
みんなの回答
- MIYD
- ベストアンサー率44% (405/905)
詳しいメカニズムは分かっていないと思いますが、 DNAが細胞内に入ります
関連するQ&A
- 大腸菌E.coli JM109(pDTG601)ってなんですか？
はじめまして。 私は化学をやっているものなんですが、論文を読んでいたらE.coli JM109(pDTG601）と物が使われていました。調べてみて大腸菌まではわかったのですが、そのほかのJM109(pDTG601)の意味がわかりません。 わかる方いらっしゃればよろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAクローンと過剰発現について
すみません。初歩的な質問ですが、混乱しています。 特定のヒト遺伝子をE.coliに発現させる場合、 DNAフラグメントをプラズミドに挿入してトランスフェクションするは分かるのですが、挿入するDNAフラグメントはある程度特定できるものなのでしょうか？全てのフラグメントとなると膨大な数になってしまいますが、かといって特定方法がわかりません・・・。 また、その遺伝子をE.coli内で過剰発現させる場合、強力なプロモーターを使うことは想像つくのですが、DNAをプラズミドに挿入する時に一緒に混ぜてしまえば良いのでしょうか？何処でどう組み込めばいいのか、こちらも方法がよくわかりません。 分かる方ご回答頂けると助かります。宜しくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- トポイソメラーゼについて
TOPO（invitrogen）というキットがあります。 トポイソメラーゼ（TOPO)ってライゲーションに使えるのですか？ 立体構造に関する酵素だと習ったのですが。 http://ja.wikipedia.org/wiki/DNA%E3%83%88%E3%83%9D%E3%82%A4%E3%82%BD%E3%83%A1%E3%83%A9%E3%83%BC%E3%82%BC
- 締切済み
- 生物学
- 組換えプラスミドベクターを制限酵素処理する実験から得られることは
実験から自分で判断しなければいけない問題があるのですがよく理解できないのでわかりやすく教えてもらえると助かります。 実験の概要は以下です。 まず、PCR法でE coli LE392の16srRNA部分をターゲットとして増幅させます。その後、(A)プラスミドベクターpBluescriptIIKS(-)と(B)PCR法で増幅させたE coli LE392の16srRNA部分を制限酵素XhoIで処理します。 その後プラスミドベクターpBluescriptIIKS(-)（制限酵素処理済）とE coli LE392の16srRNA部分（制限酵素処理済）を混合させ、ライゲーション反応を起こさせ、プラスミドベクターとPCR増幅部分を結合させます。その後、この混合液をコンピテントセルに挿入し形質転換させます。 ここまでで組換え体を作っています。 その後、コンピテントセルからプラスミドを抽出します。 最終的に生成された組換えプラスミドDNA溶液を(1)XhoIと(2)EcoRIの制限酵素で処理したものをつくりアガロースゲル電気泳動で泳動後、バンドの位置を確認するというものです。 ここで、問題が出てくるのですが、組換えプラスミドをXhoIとEcoRIで制限酵素処理しますがベクターpBluescriptIIKS(-)に対しPCR産物がどういう向き（センス、アンチセンス）で入っているのかを調べないといけません。 どのように考えたらいいのか教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパクの発現に関して
あるタンパクの発現を試みているのですがまったく発現しません。意見をいただけると幸いです。よろしくお願いします。以下条件です。 使用ベクター：Qiagen pQE30 発現させるタンパクの由来、鎖長：植物由来、約800bp ホスト：E.coli M15[pREP4]およびBL21(DE3)plyS 培養条件：37℃で培養後、OD600=0.6のとき1mM IPTGを添加、その後25℃で一晩培養。 そのほか、SDS-PAGEにて可溶性・不溶性画分どちらも調べましたが、目的タンパクはありませんでした。ベクター＆インサートDNAはBamHIおよびPstIで切断し、ライゲーションしました。シークエンスも確認しましたが問題ありません。 必要なことがあれば追加します。どんな些細なことでもかまいません。どしどし意見をお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 制限酵素サイトの異なるライゲーションについて
現在、あるベクターから別のベクターへ配列を移し替えようとしているのですが、ベクターとインサートの制限酵素サイトが合いません。ベクター側はEcoRIとBamHIで、インサート側はEcoRIとNotIで切り出したいと考えています。このような場合何かいい方法はありませんでしょうか？ 現在考えているのはベクター、インサート共に両側を平滑化する方法なのですが、向きが決まらないことと、現在まで平滑末端でのライゲーションの経験がなく、研究室内でも成功率が低いので他にいい方法がないかと思っています。 もしくはインサート側をＰＣＲで増やすことも考えたのですが、プライマー作製の時間を考えると、平滑化したほうが手っ取り早いのではないかと思っています。 また、現在まではライゲーションによって環状ＤＮＡを作ることしか行ったことがないのですが、上記のような末端を持つもの同士をライゲーションした場合、EcoRIのみで結合した直鎖状のＤＮＡが出来るのでしょうか？もしそうなのであれば、その後末端を平滑化してさらにライゲーションするという方法もありますよね？ 勉強不足で申し訳ありませんが、何かいい知恵をお持ちの方がいらっしゃいましたら拝借させていただけないでしょうか？
- 締切済み
- 生物学
- XhoI-SphI のライゲーション
XhoIとSphIで1700bpのPCR産物をクローニングしようとしていますが、形質転換効率が非常に悪く、わずかに形質転換されたコロニーにもインサートは入っていません。 XhoIがPCR産物を分解しにくいという話はよく聞きますが、私は今まで別の遺伝子のクローニングに使って問題ありませんでした。今回のプライマーにも、上手くいっていた遺伝子をクローニングした時と同様、プライマーの制限酵素サイト外側に４塩基つけ、３７度二時間処理しました。 XhoIは、PCR産物の違いによって、同じ条件で処理しても切れたり切れなかったりするのでしょうか。 ライゲーションの方法自体に問題がないことはコントロールで確認した上で、ライゲーションの前後のDNAをアガロースゲルに流してみました。 ライゲーション前はベクターとインサートが問題なく見え、ライゲーション後は、バンドがいくつも見えました。いくつも見えたバンドの中には、 １．インサートのバンド ２．制限酵素処理したベクターのバンドよりやや小さいバンド ３．それからサイズのもっと大きいバンドが４本 でした。 一瞬、２．のバンドはきちんとライゲーションして環状になったものかと思ったのですが、このバンドは、使用したベクターよりはるかに明るいので、インサートが連なったものと考えるべきでしょうか。（因みに使ったインサートはベクターよりかなり多い）結局はこれを見ただけではライゲーションが上手くいっているのかわかりません。 XhoIを使われて同じような経験をされた方、どうぞアドバイスお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- 大腸菌の形質転換を利用したクローニング
先日実験で、大腸菌の形質転換を利用したクローニングを行いました。 集菌と科学的処理 (1)大腸菌の培養液を氷上で冷却した。 (2)培養液5 mLを遠沈管に移し、3000 rpmで5分間遠心した。 (3)大腸菌のペレットを崩さないように上側にして、培養液の上澄みをデカントして捨てた。 (4)あらかじめ冷やしておいた形質転換用溶液（TSS）500 nLにDMSOを25 nL入れて、混ぜた。 (5)(4)を500 nL加えた。 (6)ボルテックスで穏やかに撹拌して、ペレットを縣濁した。 (7)懸濁液を100 nLずつエッペン管に分注して、形質転換に用いた。 (8)ライゲーション反応のDNA溶液を5 nL加えて、指先で軽く撹拌した。 (9)氷上に14:05～14:25頃まで放置して、DNAを取り込ませた。 寒天培地への植え継ぎ (1)DNAを取り込ませた大腸菌に500 nLのLB培地を加えた。 (2)37℃で15～60分インキュベートして、抗生物質耐性遺伝子が活性化するのを待った。 (3)別の遠沈管に大腸菌を50 nL移し、BL培地を250 nL加えかさあげした。 (4)それぞれの遠沈管に40 nLの100 mM IPTGと40 nLの40/mL X-galを加え、軽く撹拌した。 (5)100 ng/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地2枚に、それぞれの遠沈管の大腸菌を撒いた。 (6)滅菌したスプレッダーで水気がなくなるまで満遍なく広げた。 (7)37℃の気相インキュベーターに入れて、一晩放置した。 このような手順で実験を行ったのですが、全くコロニーが出来ませんでした。 なぜでしょうか？ よろしくお願いしますm(__)m
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
回答ありがとうございました。 氷上でなければならないのでしょうか？もう少し詳しくわかりましたらお願いします。