probeをつくりたいのですが

質問

現在ある物質（ここではAとさせていただきます）のprobeをつくろうとしてします．
Aを含むと思われる細胞（血液（白血球）、cell line、培養細胞等）からRNAを抽出し、paperを参考にして、primerを3種類購入し、PCRを行ってるところですが、なかなかAのmRNAがひっかかってくれません。（RNA自体はそこそこ取れています）
手技的なもの、試薬の精度以外で、なにかPCRで目的とするmRNAをひろうよい方法はないでしょうか？

漠然とした質問ですみません

回答No.2

kamui_kakiyo · ベストアンサー

1です。
補足に対するコメントです。

ノーザンで発現差を検出するのが目的であれば余計にですが
「確実にPCRが回る条件（細胞）をおさえておくと
トラブルシューティングが容易になります」
という意味でポジティブコントロールをと書きました。

今回でいえば、
「最もAのmRNAが多いと思われる細胞を用意する」のがベストでしょうが、
発現条件等が正確にわかっていない場合はむずかしいですね。
しかし、
すくなくとも文献の通りの細胞を用意すれば確実に回るはずですよね。

お礼

ご回答ありがとうございます．
確かにおっしゃられるとおりなのですが、なかなか思うとおりに行きません。
それが実験なのかもしれませんが。

回答No.6

M_Biologist

質問には逆転写反応に関する記述が見られませんが、
PCRをする前に逆転写反応でcDNAを作っていますか？
PCRでRNAは増やせませんよ。
逆転写する場合は、oligo dTもしくはrandom primer、gene specific primerを用いますが、どれを使っていますか？

お礼

probeできました。
ご回答ありがとうございます。

回答No.5

robita

yabunaisya2さん、こんにちは。

臨床系のお医者様に対し、厳しいことを書くのは気が引けますがお許しください。

yabunaisya2さんの質問内の用語が不正確なのと情報が少なすぎて的確な回答ができませんよ。probeうんぬんより、yabunaisya2さんはRT-PCR自体がうまくいっていないのでしょう。RT-PCRは学部学生でも教えれば1週間ほどでできる手法なのですから、それがうまくいかないのであればyabunaisya2さんの実験自体に問題がありますよ。

もし、差し障りがなければ以下のことを補足していただけませんか？
１）RNA抽出法は何を使用しているのか。（キットを使用しているのであればキット名）また、Total RNAの抽出なのかmRNAまで精製しているのか？
２）RNAが取れていることを何で確認していますか？
３）逆転写の試薬とその条件（試薬名、逆転写時のプライマーは何を用いているか、基質となるRNA量など）
４）PCRの試薬と条件（試薬名、鋳型量、もしよければ使用しているサイクラー名なども教えてください）。
宜しくお願いします。

あと、アドバイスですけど
AのmRNAが高発現している臓器から抽出して実験は行いましたか？yabunaisya2さんはお医者さんのようですから、標的としている種がヒトですと臓器の入手が難しいでしょうが、ヒトのTotal RNAは試薬メーカーで購入可能ですので検討してみてください。また、ヒト、マウスのcDNAでしたら今はわざわざ苦労して釣っている人はいませんよ。例えばNEDO、RIKENでfull length cDNA cloneのプロジェクトが走っており（いた？）、そこからfull length cloneの購入が可能ですし、IMAGEを購入するのも手でしょう。ただ、IMAGEは一時期品質がひどかったので個人的にはお勧めしません（今は改善されているようです）。

それとRT反応後はtakumicchiさんが指摘されている通り、インターナルコントロールでPCRを行ったほうが良いですし、培養細胞を用いる場合は名前が同じでも継代しているうちに違う株になってしまうことがあるので注意が必要です。

お礼

詳しくアドバイスしていただきありがとうございす。
なんとかAのprobeを作ることができました。
というより、robitaさんのおっしゃるとおり、RT-PCRがうまくいきました。
うまくいかなかった原因は、RNA量が少なかったのだと思います（吸光計でRNA量を測定しています）。

回答No.4

takumicchi

ノザンをする前にRT-PCRでライセート中にAのmRNAがあるかどうかを確かめるということでしょうか？

質問文にはmRNAはそこそこ取れていますと書かれていますが本当でしょうか？
RNAの大半がtRNAやrRNAで、mRNAはほんのわずかしか含まれませんよ。アガロースゲル電気泳動や吸光度だけでは判断できません。通常ノザンやRT-PCRを行う場合はインターナルコントロールというものをとります。それはRT-PCRに関していえばハウスキーピング遺伝子のmRNAです。ノザンならU6-RNAとかが一般的でしょうか？つまり、インターナルコントロールが検出できなければトータルRNAの質の問題になります。

他に考えられる原因として
・スタート時のmRNAの量
・PCRの反応条件とサイクル数
・プライマーのデザイン
などでしょうか。

もう少し具体的に書いていただけたら、より的確なアドバイスが出せたかもしれません。

それから論文はあくまでも他人がやったデータです。
必ずしも再現が取れるとは限りません。
特に細胞系でしたら、まったく同じ細胞をそのラボからもらってきて同じ飼い方をしているなら別ですが、
そうでなければ状態は大きくかわります。
鵜呑みにしないのがベターだと思います。

お礼

ご回答ありがとうございます。
なんとかAのprobeを作ることができました。

回答No.3

kamui_kakiyo

＞なかなか思うとおりに行きません。
そうですね。
例え論文といえども、
内容やターゲットが特殊であったり新規性に富んでいる場合は
若干「こつ」を隠されている場合もあります。
そうすると、再現性が低かったりする場合もあります。

また反対に、自分のラボでの常識が
実は非常にカスタマイズされた特殊な方法である場合もあります。
基本に立ち返ってみて、M&Mの通りに一回やってみるのもいいかもしれません。

思いつきですが
配列はわかっているのでしょうから、ゲノムからDNAをクローニングして
細胞内で高発現させ、mRNAを回収。とりあえずcDNAだけは確保する
という事も可能かもしれません。

お礼

たびたびのご回答ありがとうございます。
おかげささまで、Aのprobeを作ることができました。

回答No.1

kamui_kakiyo

とりあえず、
Aを含む細胞とAのmRNAを含む細胞は意味が違いますが大丈夫ですか？
目的がcDNAのクローニングなのかそれとも条件による発現差の検出なのかでだいぶ変わりますが
タンパクがあるなしよりもより高発現な状況の細胞を用意する方が良いと思います。
すでに報文になっている情報を元にPCRをまわすのであれば
まずは、ポジティブコントロールとして
細胞の条件も再現してやってみてはいかがですか？

補足

早速のご回答ありがとうございます．
一応、AのmRNAを含むと想定される（文献的に）細胞を用いています。
最終的には、条件に発現差をNorthan法で検出することを目的としたprebe作りを行っています。

>まずは、ポジティブコントロールとして
>細胞の条件も再現してやってみてはいかがですか？
すみませんが、この分の意味がよく分からなかったのですが、文献で用いられててる細胞を使ってポジコンをということですか？