ＲＮＡ実験について

質問

生物実験を行う上で全く知識が追い付いてないので質問させてください

TotalRNAを得る過程です。
1.DEPC水とかはオートクレーブするわけですが、普通に開けてしまっていいのでしょうか？つまり、
クリーンベンチなどの無菌的な環境で使用しなくてもよいのでしょうか？（PBSとかも）
2.キットとかにサンプルの上限量とか書かれていますが、そもそもサンプルの量ってどうやって測ればよいのでしょうか？対数増殖期の微生物を集菌して、洗浄して、1.5ｍｌのチューブに0.5ｍｌ分注しているのですが、ペレットとして得られる量はまばらですし・・・。あらかじめ分注しておくチューブの重さを測定して・・・なんて面倒なことはしませんよね？
3.得られたRNAを吸光光度計で精度を確認したいのですが細かな操作がわかりません。そもそもRNAの量ってどうやってわかるのでしょうか？
また、測定する際、得られた沈殿（エタ沈したもの）を50μｌのｍｉｌｌｉＱに懸濁させてさらに50倍に薄めて測定とかだとダメでしょうか？
4．上で得た懸濁液って保存が効くのでしょうか？それともエタ沈状態で凍結保存でしょうか？そうなると吸光度測定とか出来ない・・・うーん、わからないです＞＜サンプルをちょっとだけ取るとか出来ませんよね？

文章力もなくて恐縮ですが、よろしくお願いします

回答No.1

larme001 · ベストアンサー

>生物実験を行う上で全く知識が追い付いてないので質問させてください
とおっしゃるなら生化学実験のための参考書をしっかり読んだり、あるいは詳しい人にやり方とか原理をしっかり教えてもらってその「知識」を補うのがベストではないでしょうか？限られた文字数で、断片的な状況で一方的に回答しても多分解決にはなるとは思えませんね。いくつかご質問されていることも基礎的な内容と、そもそも何が目的なのか、どういう実験なのかがはっきりしないことが混在しているのでどなたでも回答しづらいかと思いますよ。

1. そもそもDEPCをオートクレーブするのはDEPCの分解が目的であって無菌が目的なのかは用途によります。最も、RNA操作におけるオートクレーブの是非は色々議論がありますけど詳細は省略。

2. キットが「何」なのか、サンプルが「何」なのか、その後のアプリケーションと求められるモノが「何」なのかによって理由は変わります。が、まああくまで一般的に考えればキットの言う上限量の出発材料を無理やり入れて抽出しようと思ったら極端に収量や純度が落ちるんだろうなというだけでしょう。つまり、キットので回収できる条件の限界点以外の何者でもない。

3. 50倍に薄めたなら50倍に逆算して大元の濃度をもとめていけない理由はあるのでしょうか？まあ、何事にも「有効な濃度範囲」というものは存在しますから、おおすぎたり少なすぎれば適切な測定は難しいでしょうね。細かな操作という意味がわかりませんけど、それこそ本とか見れば詳しく書いてあるはずですよ。分からなければわかる人に習うべきでしょうし。

4. 本当に綺麗なRNAなら-80℃のディープフリーザでそれなりに保存が効きます。ただ、凍結融解は当然RNAを痛めますので場合によっては完全長のRNAが少なくなるとかあるかもしれませんね。タンパク質もそうですが、この手の「保存できるかできなか」というのはあくまで一般論であって、場合によっては保存するべきでない用途もありますよ。その実験がどのくらいコストがかるのか、何回もできる実験なのか、コントロール等で保存が問題あった場合に確認可能か、その他色々な条件を総合的に踏まえて一気にやってしまうべき実験か（多少時間的に辛くても）あるいは、保存しても問題ないのかは考えるべきでしょう。あと一般論としては、水よりも75エタ中で保存したほうが安定という話もききますけどね。

　文章力とかは自分も偉そうなことを言える立場ではないのでアレですが、とりあえず立場はどうであれ本当に困っていて今後解決していく気があるなら第一選択はそのような曖昧な知識で中途半端にネットで質問をするのではなくてきちんとした基礎実験書とか知っている人とかその他ちゃんとしたもので学ぶのが先決でしょう。

回答No.2

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私の経験則です。

1.
普通に気を付けてれば問題ありませんが、クリーンベンチで作業する方がベターです。

2.
普通は菌や細胞の量から、経験的に分かります。
上限は一般的な量ではないので、普通にやってれば超えることは稀です。

3.
これは普通に調べれば出ると思います。
薄めるのは問題ありませんが、定量限界以下にならないよう気を付けて下さい。

4.
懸濁液での保存は問題ありません。