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限界希釈法について

私はいま、KO細胞を作成しています。方法としてはKOコンストラクトを用いてエレクトロポレーションで細胞に導入していますが、遺伝子破壊株を単離出来ていません。 そこで限界希釈法をするのですがどう希釈するか悩んでいます。 流れとしては、細胞を5×10^6集めてエレクトロポレーションによりKOコンストラクトを導入しています。 この時点で生き残る細胞数は予備実験から60細胞とわかっています。 これを1ml中に1細胞になるように限界希釈をしようと考えてます。 どのように希釈をすれば効率がよいでしょうか? アドバイスをお願いします。

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  • 生物学
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   普通の培養細胞で「限界希釈」するならかなり少なめにしてから100 ulづつ程度96wellに播種してある程度培養してから単一のクローンが入っているwellを確認するといった形になります。 まあコツとしては「1/2 cells/ ml (well?)」ぐらいを目安に、実際の欲しい量よりも少なめに計算して薄めます。そうしないと意外と複数はいったものができてしまうからです。薄め方も一度に1/1000とかよりも/100から1/10程度で段階的にやったほうが上手くいく気がします。この場合当然入っていない場所もできるのですが、複数入るよりはマシでしょう。60/60でそれぞれ完全に分けて入れることは基本的には無理です。  ただ、自分自身ESとかをあつかったことはないのですが、ESの場合はコロニーをチップですってそのまま移すとかでやるのが多いのではないのですか?

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質問者からのお礼

アドバイスありがとうございます。 もともとはコロニーからそのまま吸い取って単離を試みていたのですが、複数混ざってしまうことが多くて・・・そこで限界希釈法をやることにしたのです。

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