検量線について

質問

LC/MS/MSの機械で定量の測定を検討してます。
横軸に既存の濃度(自己で調製)を調製して，縦軸に内標準物質との
比率をスポットしてある濃度レンジで検量線を作成の検討を行って
います(濃度レンジとしては2000くらい)。
低濃度側では緩やかに起き上がり、中濃度で傾きが大きく、高濃度で
また緩やかになります。
Ｓ字曲線を描きます。
これはどういうことでしょうか？バイアルへの吸着の場合は、低濃度で
理論値が出ないってことはあると思いますが、ある部分部分で傾きが
微妙に変わるってのが、よく分かりません。
ご教授お願いします。

回答No.5

kgu-2 · ベストアンサー

No2です。

>下をメインにしたいので
定量限界以下で測定するのは、無理。測定可能範囲で。
主として金属を測定しています。キレートを利用していた時代は、ppmオーダは困難でした。原子吸光だと、簡単に測定できるようになりました。サンプルがppbオーダの超微量分析になると無理になり、フレームレス。
　ppbオーダを超えるとMSでしょうが、測定法以前の試薬や機器のメンテナンスが出来そうもないので、手を出していません。
　定量下限では、金属の世界では、サンプルの濃縮を考えるのが普通です。

　フレームレスでは、2つの問題にぶつかりました。一つは、試薬の問題。処理するときに硝酸などを使うのですが、この中に入っている金属が誤差になり補正が必要なくらい混入しています。精密分析用を買っても、金属によっては油断できません。もう一つは、Znはバックグランドが高くて、業者に行っても「下駄が高いので」と回答され、測定不能。

　LCはともかく、MSは普通の分析とは別世界の超微量分析です。その専門書を読まれましたか。私は、それ以来、手洗い、蒸留水、試薬の不純物、容器などにも気を配るようになりました。

　S字カーブになるのが事実なら、解消できません。原因の推定は重要でしょうが、現実にはS字を解決できないでしょう。検量線が直線ならスッキリしますが、直線である必然性はありません。抗原－抗体反応なんぞは、対数変換しても、変なカーブです。
　S字の検量線のどの範囲が信頼できるか、を把握し、誤差を考慮して定量されることをお勧めします。すなわち、３回以上測定し、バラツキが5%以内なら安心できます。
　釈迦に説法の点は、ご容赦を。

回答No.4

swisszh

1)　回答３のものです。　２）detector fluorescence は　ナノｇ　単位で測定でき、物質によっても１００ｐｇ　（絶対値）でも充分はかれます。　３）機器製造所の専門家に問い合わせてみたら。　４）機器を使っている人がわかることで、上でただ命令する人々は何もしりません。５）Vial への吸着などは自分で実験して証明しないと、ただ思うだけでは、なんにもならないのです。　GOOD LUCK

回答No.3

swisszh

1) LC/MS/MS の　detector によるはずです。ＬＣ/MS/MS は　ＬＣ　と比較して、まだそこまで発達していません。それに、定量の検量線はいつも同じ時に、同じ濃度くらいの所で、しないと、機器自体が、とくにdetectorは２－３週後では、同じ状態ではありません。　２）　ですから　LC/MS/MS で物質を判断して、定量は、ＬＣ　でおこなうと検量線も比例状態がいいです。特にfluorescence detector は検量線はよくなります。　でも定量はいつも同じ時に、検量線を作って比較すること、それは分析の基礎です。同じものならば、数回、定量している内に、検量線の２－３点で、機器が正常かどうかよく判断できます。　３）定量分析はいかに機器が正常かどうかを判断し、　濃度を機器のbestにあった所にもっていくかによります。　GOOD LUCK

お礼

ありがとうごさいます。
ディテクターを蛍光やＵＶにすることで
再現性はいいかと思いますが、定量の下限が下のもので、
ＭＳでないと追いつけないというのが実情です・・・

回答No.2

kgu-2

>Ｓ字曲線を描きます
生化学の酵素反応では珍しいことではありません。

>低濃度側では緩やかに起き上がり
　一つの可能性としては、容器やカラムに吸着する。一定の割合でなく、一定量が吸着しますので、低濃度ほど吸着されて、理論値よりも小さくなります。吸着するだけさせておいて、それを対照として利用することが考えられます(吸着かどうか判断できませんが)。

>高濃度でまた緩やかになります。
「頭打ち」と表現されるものでは。原子吸光では、ありふれた話です。ですから検量線は、直線ではなく、対数で描くことが多い。私は、２次式で描いていますが。手計算の時代は、直線回帰でないと大変でしたが、いまはパソコンがあるので、どんな回帰式でも使えるので、相関係数の高い回帰式を選択しています。

お礼

ありがとうございます。
確かに、吸着と頭打ちが同時に起こると
低濃度と高濃度側で理論濃度のエリアが出にくいですね。
どちらかというと下をメインにしたいので、吸着の可能性を視野に
入れて、調製方法の改良を行いと思います。

回答No.1

noname#160321

「真の」原因が何であるかは置いといて、測定するとき検量線がＳ字カーブになることは非常によく起きます、七割がたはそうなります。
で、今必要なのは、１.信頼度の高いデータを得ること。２.検量線の直線性を全範囲で維持する事。３.両方。のうちどれでしょうか？
さしあたって測定を信頼度高く行ないたいなら、検量線の中間部にサンプル濃度が来るように試料調製を行ないます。
「研究」になっても良いから検量線の形状を解析したいなら、まず装置メーカの研究所に相談し、次いで文献検索からはじめて、最低でも三ヶ月長いと十年これに集中します。

お礼

ありがとうございます。
必要としているのは、定量するにあたり信頼性のあるデータを得る、そして検量線の濃度範囲で直線性を維持することですね。
レンジを短くすることも手ですが、定量下限は維持しないと・・・
すると、上を短くするようになるのですが。
原因は置いといて、とりあえず直線を引けるようにするのが先決としてます。重み付けはありです。