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SDSのサンプルバッファー処理のタイミング
今、卵子の透明帯をSDSPAGEしようと考えています。 サンプルバッファーに試料を入れて、熱を加えた後に冷やしてサンプルインするのはわかるのですが、どの段階でストックしておくのが望ましいのでしょう？ 熱を加える前に冷凍保存した方が良いのでしょうか？また熱を加えた後に、サンプルインまで凍結保存しておくのは平気でしょうか？ よろしければご教授していただければと思います。
- yosuke0222
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- otx
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＞サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります ＞200kda以上の巨大蛋白で、もともとvivoでも不安定な蛋白でそうでした。 もともと不安定なタンパク質ということなら、SDSのサンプルバッファーでどうこう言うものでは無いと思います。 もともと、SDSサンプルバッファーは、SDSをきちんとタンパク質に結合させる過程がなければ、その意味を持ちません。 そのため熱を加えたり、少なくとも室温で数時間処理するといった過程が無いと、毎回の実験ごとにSDSがタンパク質に結合する度合いが違うということになります。
- ga111
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>横レスになりますが、どのようなタンパク質でそういうことがあるのでしょうか？ 200kda以上の巨大蛋白で、もともとvivoでも不安定な蛋白でそうでした。TCAで前処理して、プロテアーゼをより強力に不活性化しても、そうなりました。当該サンプルは、コントロールとして、１０回以上しようしておりますので間違いではないでしょう。 「卵子の透明帯」については経験がありませんが、加えて、サンプルバッファーを入れないで保存できるならそれも試してみるといいでしょう。ちなみに８-９割くらいの蛋白は大丈夫かも（すべて同じ結果になる）しれません。
- otx
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＞まじめにやるのなら、両方試します。サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります。非加熱のサンプルも試すといいでしょう。 長年タンパク質をメインにつかった解析をしている者として、 「SDSを加える条件では」、このようなことは聞いたことありません。 横レスになりますが、どのようなタンパク質でそういうことがあるのでしょうか？
- ga111
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これは、対象の蛋白によるので、一般論はありません。 まじめにやるのなら、両方試します。サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります。非加熱のサンプルも試すといいでしょう。
- otx
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熱を加えた後に、保存するのであれば凍結すればいいです。 ただ、次に泳動で使う場合、また熱を加えてアプライしましょう。 この辺のことは基本的な実験書に書いてあるので、 労せずやり方は手に入ると思われます。
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