エレクトロポレーションについて
エレクトロポレーションで形質転換をしている生物系の大学4年生です。
以下の手順で形質転換をしています。
ＰＣＲで増幅
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アガロースゲル電気泳動
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目的分子量のバンドをDEAEセルロースペーパーで吸着・切り出し
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洗浄・溶出
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エタ沈(CH3COONa 最終濃度0.3Ｍになるよう添加、2倍量エタノール添加)
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滅菌水に溶解、blunt end処理(タカラDNA Blunting kit使用)
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ligation(上記キット使用、ベクターはSmaI cut済pUC19で、且つ脱リン酸化済、エタ沈も上記と同様、滅菌水に溶解)
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フェノール・クロロホルム抽出
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コンピテントセル50μｌ＋抽出した上層0.5μｌでエレクトロポレーション
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ＳＯＣと混合し37度で30min incubate後寒天培地に散布
また寒天培地はLB+ampです(IPTG,X-Gal添加し、青白判別)
エタ沈の際の塩濃度は間違えてはいませんし、培地のアンピシリンも量を間違えてはいません。
しかし白コロニーどころか青コロニーすら生えてきません。
電気穿孔時しょっちゅう火花が散ってしまっているのでそれが大いに原因なのでしょうが、そうでないときでTime constantがけっこうなときですら、1つも生えてきません。
特にお聞きしたいのが３点ありまして
・切り出したＤＥＡＥペーパーから抽出したものからエタ沈する際に、塩が必要なのか(もともと溶出液はNaCl含有)
・共沈剤を入れないとやはり収率が悪いのか
・キュベットの水気はしっかりと取っているのに火花が散っている原因はそもそもどこにあるのか(残留塩濃度が高すぎるのか？)
以上です。院生に質問してもう日を傾げられてしまいまして・・・
よろしくお願いします。
お礼
申し訳ありませんでした。移動します。