定量的ＰＣＲで増幅率の異なるアッセイ間の補正方法

質問

定量的PCRの増幅率（Eff)が、毎回のアッセイごとにずれてしまい、
各アッセイ同士を比較することが出来ません。

増幅間のことなるアッセイ間のデータを比べる際の補正の
方法を教えてください。

回答No.2

CTAB

補足ありがとうございます。

>毎回のアッセイごとに、スタンダードを立てています。
>また、House　Keeping　Geneも同時に測定を行い、目的Geneは、
>常にHKGに対する比で計算しています。
　ということは、目的Geneのスタンダードは立てていないのですか？　それとも目的GeneとHKGの両方のスタンダードを立てて2回分の定量PCRを同時に行っているのでしょうか？　（と思いましたが、2回分を同時に・・・ならHKGの比から計算することはないでしょうから、やっぱり目的Geneのスタンダードは無しで、HKGからの比でのみ計算していると言うことですよね、きっと）

　うーん、私も理論上ずれは生じないと言う意見には同意するのですが、それでも理由を考えるならば、アッセイの調製が原因のような気がします。
　HKGと目的Geneのサンプル調製では、プライマーは別々の物ですよね（あたりまえですが）。probe-qPCRなのかFluorescence-qPCRなのかは解りませんが、プライマー/プローブ溶液をHKGのサンプルと、目的Geneのサンプル用のチューブに別々に入れているはずです。そのために、調製の際に、プライマーの濃度やTotalの溶液濃度や溶液組成に差が出てしまっているのではないでしょうか？
　わたしは定量PCRをする時は、テンプレート以外はMixtureから調製して、何々からの比ではなく直接目的Geneのコピー数を計算していました。

　補正方法としては、HKGと目的Geneを両方含むDNA（普通に目的Geneを持つTotal-DNAでいいと思います）をHKGのプライマーで行うサンプル群と目的Geneのプライマーで行うサンプルの中に含ませて定量PCRを行い、その差を実験誤差として、定量PCR毎に結果の再計算に利用する、とかでしょうか。
　mo---moさまは、RT-qPCRをやっているのかな、という印象でお答えているのですが、genome-DNAを入れておけば目的GeneとHKGのコピー数は理論上同数になるはずですし（バクテリアで目的Geneがプラスミドの場合や、真核でイントロンを含んでいる場合はその限りではありませんが）、ズレを再計算しやすいと思います。

　また、余りに改善されないようなら、目的Gene用のスタンダードを調整してみるのが一番いいと思います。

お礼

ご丁寧な回答ありがとうございます。

目的Gene用のスタンダードに注目しながら、
注意深くアッセイを行っていきたいと思います。

回答No.1

CTAB

少しわかりにくいので補足をお願いしたいのですが、増幅効率がずれて困る、と言うのはどういう意味ですか？
　そもそも定量PCRは各アッセイ間で、増幅効率などのデータを比較することはないと思います。
　処理毎に増幅効率などから計算を行うわけですから、定量PCRで結果として得られるのはその処理で行ったDNAのコピー数のみであり、そのコピー数をアッセイ毎に比べるはずです。

　もしスタンダードをアッセイ毎に立てずに、一度だけ行ってそれを全てのRunで用いようとしているなら冒険を通り越して無茶ですし、スタンダードを各プライマーペアごとに作り直していないようなら、プロトコルがおかしいです。もしきちんと行われているなら中傷をしているようで申し訳ないのですが、その辺を踏まえてもう一度困っている内容をまとめていただけるとある程度アドバイスできるかと思います。

補足

補足を行わせていただきます。

毎回のアッセイごとに、スタンダードを立てています。
また、House　Keeping　Geneも同時に測定を行い、目的Geneは、
常にHKGに対する比で計算しています。

この比が、毎回の増幅率が違うことで影響を受け、同じ条件の測定を行っても、0.8～1.5ほどの変動が生じてしまうのです。

理論上、ずれは生じないはずなので困ってます。
もし、補正方法が分かるのならば教えてしただけますでしょうか？