RNAの抽出について

質問

今大学でtotal RNAの抽出を行っているのですが、糖類が多く含まれ抽出液が粘液状になってしまいます。
KITは用いていません。何か糖を除去するのにいい方法はありませんか？
塩化リチウムを使ってみたのですがあまり効果はえられませんでした。
超遠心は用いていません。

よかったら教えてください。
（超遠心はあります、よければKITを用いない方法で）

回答No.5

noname#66476

何からRNAを抽出したのですか？
スケールはどのくらいですか？
どのくらいの長さのRNAを得たいのですか？

夾雑物は多糖類とは限らず、場合により様々な性質のものがあります。
クエン酸やLiClで多糖類を除くプロトコルはあまり良くないことが多いですね。

回答No.4

teru-arai

＞お勧めのプロトコールなどありませんか？
#2です。お勧めと言いますか、昔用いていた超遠心を用いたプロトコールは以下の本に記載されてます。
モレキュラークローニング第2版だと7.19に記載してあります（第1版にも載ってますが、第3版では削除されてます）。カレントプロトコールモレキュラーバイオロジーだとユニット4.2、グアニジウム法の所に記載されてます（ちなみにユニット4.3がフェノールSDS法です）。
超遠心でグリコーゲン以外の糖が除けるのかどうか知りませんが、RNAは5.7M CsCl中で沈殿する唯一の生体分子と書いてあった気がするので（曖昧ですみません）取り除けるかもしれませんね。ただ、超遠心すると手間はすごくかかります。それから、沈殿にするため有る程度のRNA量が無いとつらいです。
別法としては、オリゴdTカラムを通してmRNAにしてしまえれば、糖類などは自動的になくなると思いますが、粘性高くてカラム無理ですか？

回答No.3

geneticist12

>はい。AGPC法です

オリジナルの方法では、水層に1/2 volのプロパノールを加えてRNAを沈殿するようになっていますが、これではpolysaccharideが一緒に沈殿するので、改良法が報告されています。1/2 volのプロパノール代わりに、1/4 volの1.2 M NaCl/0.8 M クエン酸ナトリウムと1/4 volのプロパノールで沈殿します。Molecular Cloning最新版のプロトコールにも採用されています。

それでもpolysaccharideの沈殿がひどいようでしたら、沈殿を直接2 M LiClで溶かして（2 M LiClを少しずつ加えながら、pestleなどホモジナイズするように溶かす）、低温で遠心するとpolysaccharidやDNA、低分子量のRNA (tRNA)を上清に残して沈殿できます。ただし、低分子量のmRNAやmicroRNAは失われる可能性があります。

蛇足ですが、超遠心を使う方法では、GTC-CsTFA（チオシアン酸グアニジン－セシウム・トリフロロアセテート）法がup-to-dateでしょう。
ただし、試薬が高く（キットの法が安上がりなくらい）、手間がかかるわりに、精製度はAGPC法と大差ないと感じです。Molecular Cloningの古い版には出ていたかと思いますが、最新版では不採用です。

回答No.2

teru-arai

詳しいことがまるで書いてないため、私の昔の話がお役に立つかどうかわからないので、ざっと書きます。
昔ラットの肝臓からRNAを抽出していました。ご存じの通り肝臓にはグリコーゲンが蓄えられています。まだ、アシディックフェノール法がなかった時代で、超遠心でRNAを精製しておりました。
5.7MのCsClのクッションを敷き、超遠心してＲＮＡをペレットとして回収します。グリコーゲンはクッションに入らない、CsClのすぐ上の層にきますのでRNAと簡単に分離できます。

補足

なるほど。ありがとうございます。
お勧めのプロトコールなどありませんか？
いろいろ検討してSDS-phenol法というものでやってみようと思っているのですが。。。

回答No.1

geneticist12

いまやっているのはどのような原理の方法ですか？AGPC法ですか？

補足

はい。AGPC法です
そのエタ沈の操作の前段階で２MのLiClを用いました。