細胞のタンパク質発現方法とは？
- 細胞にタンパク質を過剰発現させる方法の一つに、GATEWAYシステムが用いられています。
- GATEWAYシステムは、mRNAを抽出してcDNAを合成し、特定の配列を持つプライマーを使用してPCRを行うことで、タンパク質の過剰発現を実現します。
- 1回のPCRだけでは十分な増幅が得られない場合、2ndPCRを行うことでさらなる増幅を行い、過剰なタンパク質発現を実現します。
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授業で聞いたのですが
細胞に、あるタンパクAを過剰発現させる際、最近用いられている方法として GATEWAYシステム というものがあるといっていたのですが それの意味が良く分からなかったので出来ましたら、参考になるページを教えて下さい。 よろしくお願いします。 私が分からないのは まず あるタンパク質Aがある組織に発現している場合、mRNAを抽出したのちに、逆転写試薬などを用いてcDNAを合成します こののちに、attB1,attB2の配列をつけたcDNA独自の5'配列、3'配列を含んだプライマーを合成し、それを用いて１stPCRをおこないます。 その後に2ndPCRを行うと説明されたのですが、なぜ1回だけのPCRではだめなのでしょうか？ 2ndPCRを行う意味を教えていただけると幸いです。 よろしくおねがいいたします。
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２段階でPCRする意味は一気に複数の標的遺伝子を扱えるということではないでしょうか。 １段階目でそれぞれの遺伝子に短いattB配列を付加させることができれば、２段階目はattBに対するプライマーのみで増幅させることができます。 つまり、２段階目のPCRは様々な遺伝子を同じ条件でPCRできることになるので、別々の遺伝子を一度に扱えるということになり、結果、実験が効率化されます。 ですので、遺伝子を複数個クローニングするわけではないのであれば、普通にaatB配列を含んだプライマーで増幅させてもよいと思います。 http://biotech.nikkeibp.co.jp/netlink/lto/gateway/ http://www.j-tokkyo.com/2003/C12N/JP2003-159063.shtml
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