• ベストアンサー

in vitroでの実験における酵素処理の条件

in vitroでの実験でタンパク質を酵素処理し、生成するペプチドについての比較を行いたいのですが、その酵素処理の条件についてのなにかの規定みたいなものはあるのでしょうか? 遺伝子組み替え作物などの安全性審査で、酵素で消化された後にアレルゲンが生成するかどうかの検証を行う際、このようなin vitroでの酵素処理を行っているようなので、いろいろ探してみたのですが、見つかりませんでした。

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
noname#53364
noname#53364
回答No.3

当たり前のことですが何をそのペプチドで示すかでかわります。 私の場合はとあるサイトを決める事が目的でしたので、それが示される事が大事になりしたので、分解条件よりどんな断片が生成するかが重要でした。 生理学的な事をいおうと思ったら、その条件でやらねければ意味がないわけです。そうしなくてはアーティファクトになってしまうわけです。 公開できる範囲でかまいませんがもう少し条件を開示していただければ具体的なアドバイスができるかもしれません。同様な論文をひかれることが一番良いと思いますが。

kazunoshin
質問者

補足

まさに痛いご指摘ありがとうございます。 たしかに適当に定めた条件で出した結果では、意味がないと思います。 あるタンパク質を酵素で分解して、生成するペプチドの内、ある特定のペプチドがどれほど吸収される時点で存在しているかを、in vitroで調べる実験を行っています。in vivoで実験を行って、実際の消化物を調べることができればいいのですが、そのような実験を行うことができる環境にありません。 ですから、in vivoでの環境に近い条件をin vitroで再現する必要があると考えたわけです。

その他の回答 (5)

noname#211914
noname#211914
回答No.6

以下のサイトは参考になりますでしょうか? 「アレルゲンと人工消化液中での安定性」 皆さんが議論されているように「人工消化液」での問題点の指摘があります。 ・http://www.jba.or.jp/q-and-a/ex/non_flame/q23.html (遺伝子組換え技術を用いることで、新たなアレルゲンが作られる可能性はあるのか。) いくつか参考文献がありますので参考になれば良いのですが・・・? ご参考まで。

参考URL:
http://www.jba.or.jp/q-and-a/ex/non_flame/q24.html
kazunoshin
質問者

お礼

回答ありがとうございました。 たしかに人工消化液を使うにしても、それに対する問題点を踏まえた上で、使用する必要があるかもしれません。その上で、得られた結果に対して適切な考察を行っていこうと思います。

  • myeyesonly
  • ベストアンサー率36% (3818/10368)
回答No.5

そのような研究では、そのペプチドが消化管の環境下でどのくらいのスピードで分解するか、あるいは残存する時間がどの位かということを in vitro で調べるのでしょう。 とすれば、消化液の組成とpH、体温が必要な資料であろうと思います。 in vitro では、akiyamaharuka さんの仰るように人工胃液などのダミー消化液を使って研究するのが一般的だと思いますが、それは消化管の全ての環境を現してはいません。 厳密にやるのであれば、最終的には本物の消化液を使用せざるをえないでしょう。また、胆汁や腸内細菌の影響だって考える必要があります。 しかし、in vitro という実験形態がすでに厳密な環境下にはないので、人工消化液などが使われているのだと思います。ようはその上に、どこまで参考データを付加するかということになるのではないでしょうか。 また消化管内の環境については、臨床検査法提要や、内科、特に消化器関係の医学教科書にはある程度出ています。図書館などで見られると参考になろうかと思います。

kazunoshin
質問者

お礼

回答ありがとうございます。 ご指摘の参考書を探してみようと思います。

noname#53364
noname#53364
回答No.4

状況を把握いたしました。 少し検索したところやはり厚生労働省が情報を持っているようです。 このHPに人工消化液の実験が出てきますので、これを手がかりに問い合わせをされたら良いのではと思います。 また旧厚生省、農林水産省からでている~白書にも情報があると思われます。 少しは役にたちますでしょうか?

参考URL:
http://www.mhlw.go.jp/search/mhlwj/mhw/houdou/1009/h0929-1.html
kazunoshin
質問者

お礼

回答ありがとうございます。 かなり参考になりました。 もう一度実験方法を考え直してみて、意味のある実験データとなるように変更することにします。

  • myeyesonly
  • ベストアンサー率36% (3818/10368)
回答No.2

明文規定というのは知らないのですが、目的によって違うのではないでしょうか? 例えば、経口摂取で、各消化器でということなら、口、胃、小腸、大腸などの環境を再現することになるでしょうし、血中なら血液の環境でしょう。また、食品加工の過程であれば、その状態を再現するべきではないでしょうか。

kazunoshin
質問者

お礼

回答ありがとうございます 私もそのように考えて、実際のin vivoでの消化の過程を参考にしようと思ったのですが、胃、小腸における詳しい環境が書かれた本や論文がなかなかみつからなくて悩んでおりました。また、食品の形態によっても胃や小腸に停滞する時間も違うのではないかとも思いました。 悩んだ末に、適当に条件を設定して実験をしてしまっているのですが、やっぱりデータに客観性がないような気もするような・・・・

回答No.1

 うーん、私も知りたい。  私の場合は、糖脂質の分離だったので除タンパクのために Pronase K を使ったのですが、調べる論文みんな条件が違う。こまったあげく、えいやと選んだ条件でやってしまいました。うまくいったし、論文もリジェクトされなかったので、よかったのでしょうが、ほんとは何。まぁ、酵素さえ効けばいいのかもしれませんが、、、  手持ちの酵素の 説明書にある最適条件でやってしまえばいいのではないでしょうか。まれに pH によって違う反応をする酵素がありますが、プロテアーゼならきっと大丈夫でしょう。  もっと、専門家の方のフォローをお待ちしています。 ひょっとしたらJIS規格とかあったりして。   

kazunoshin
質問者

お礼

適当な条件設定では、データの客観性にかけるような気がしていました。 実際にはこの実験はもう始めてしまっていて、私もmasa1000rxさんのように適当に酵素の最適条件でやってしまっているのですが、つっこまれるとかなり痛いところのような気もしていました。 なにはともあれ回答ありがとうございました。少し気が楽になりました。

関連するQ&A

  • 異常プリオン

    遺伝子組換え作物によるタンパク質やDNAは、口に入ってから消化酵素によって、分解され、小腸で吸収される、もし吸収されなかったら排泄されるので、基本的に問題ないと考えていますが、DNA、たんぱく質はこれまで存在しなかったものとなるのでしょうか? 動物性DNAと植物性DNAを組み合わせた遺伝子作物組み換え作物もあるのでしょうか? BSEの肉粉粉は、どのような遺伝子組み換え作物だったのでしょうか? 質問、疑問点の内容が混在しますが、ご回答のほどよろしくお願い申し上げます。

  • 加水分解酵素による生成物

    以下の問題がさっぱり分かりません。 どなたか教えて下さい。 キモトリプシンはタンパク質加水分解酵素(プロテアーゼ)の一種であるが、この酵素の基質特異性は芳香族アミノ酸(フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン)のカルボキシ基側のペプチド結合を加水分解することである。次の構造式(1)(2)(以下の画像2つ)のペプチド化合物をキモトリプシンで処理したときの生成物の構造式を書きなさい。 宜しくお願いします。

  • ヨーグルトにタンパク分解酵素を入れた

    以前、あるある大辞典で、豆乳をたんぱく質分解酵素でペプチドを作るというのをやっていました。 それって、つまり、豆乳分解してを消化しやすくしただけですよね。 わたしは、豆乳が嫌いなので、ヨーグルトに、酵素を入れてみました。 苦いけど、とても口に合いました。 毎日続けられそうです。 そこで、ふと疑問に思ったことがあります。 ヨーグルトのたんぱく質は分解したけれど、肝心のヨーグルト菌は一体どうなったの? 菌も、たんぱく質でできているんですよね。 もしかして、ヨーグルト菌は死んじゃったの?

  • 消化酵素から生成される物質について

    この間、質問をしたものです。返事ができなくてすいませんでした。答えて下さった方ありがとうございました。 違う質問なのですが、澱粉の消化酵素はアミラーゼ、たんぱく質の消化酵素はプロテアーゼ、脂肪の酵素はリパーゼ というところまでは、分かったのですが そこから生成される物質がどうしても分かりません。 知りたいのですが、教えてください。

  • 酵母のタンパク分解酵素について

    今、酵母のもつタンパク分解酵素について実験をしています。 そこで文献や本を読んでいると、酵母のプロテアーゼは菌体内(主に液胞)に存在しているとのことです。 乳酸菌などは、菌体外に酵素を出し、タンパク質をペプチドの状態にしてから体内に取り込むと聞きました。 そこで疑問に思ったのですが、酵母は窒素源を得るため、分子量の大きいタンパク質を直接体内取り込むことができるんでしょうか? お願いします!

  • 酵素について

    「ある酵素反応において、反応の初期では時間と共に生成物の量が増加したが、その後生成物の増加量が減少し、やがて反応が停止した。」 このような場合、反応が停止した理由にはどのようなことが考えられるのでしょうか?またそれぞれの理由を検証するためにはどのような実験を行えばよいのでしょうか?

  • 大腸菌を使った実験における注意点

    今度遺伝子導入の発現とタンパク質の生成の実験をやるのですが、大腸菌内で異種遺伝子を大量発現させるための注意点を知りたいのですけど何かありますか? 自分は大腸菌の酵素が遺伝子の発現調節に関わる塩基配列を認識しないからなのかなと考えてますが、正しいのか確信がもてません。 どなたか教えてください。

  • タンパク質からアミノ酸までの分解

    タンパク質からアミノ酸まで分解する消化液や消化酵素を教えてくださ タンパク質 → ペプチド → アミノ酸  の経路を通るのはわかるのですが、 それぞれにどの酵素・消化液が働くのか いまいち混乱しています トリプシンとプロテアーゼはどちらともタンパク質を分解する酵素なのでしょうか? よろしくお願い致します。

  • 組換えプラスミドベクターを制限酵素処理する実験から得られることは

    実験から自分で判断しなければいけない問題があるのですがよく理解できないのでわかりやすく教えてもらえると助かります。 実験の概要は以下です。 まず、PCR法でE coli LE392の16srRNA部分をターゲットとして増幅させます。その後、(A)プラスミドベクターpBluescriptIIKS(-)と(B)PCR法で増幅させたE coli LE392の16srRNA部分を制限酵素XhoIで処理します。 その後プラスミドベクターpBluescriptIIKS(-)(制限酵素処理済)とE coli LE392の16srRNA部分(制限酵素処理済)を混合させ、ライゲーション反応を起こさせ、プラスミドベクターとPCR増幅部分を結合させます。その後、この混合液をコンピテントセルに挿入し形質転換させます。 ここまでで組換え体を作っています。 その後、コンピテントセルからプラスミドを抽出します。 最終的に生成された組換えプラスミドDNA溶液を(1)XhoIと(2)EcoRIの制限酵素で処理したものをつくりアガロースゲル電気泳動で泳動後、バンドの位置を確認するというものです。 ここで、問題が出てくるのですが、組換えプラスミドをXhoIとEcoRIで制限酵素処理しますがベクターpBluescriptIIKS(-)に対しPCR産物がどういう向き(センス、アンチセンス)で入っているのかを調べないといけません。 どのように考えたらいいのか教えてください。

  • ユビキチン化の方法について

    ある蛋白質がユビキチンープロテアソーム系で分解されるかの実験をin vitro で行いたいのですが、 一般的なユビキチン化および酵素による分解実験の方法を知りたく、質問しました。 調べてみると、キットが売られていたのですが、これを使うのが一般的なのか分かりませんでした。 http://www.funakoshi.co.jp/shiyaku/entry/987.php あと、初歩的な質問かもしれず申し訳ないのですが、 細胞外に存在する蛋白質がエンドサイトーシスにより取り込まれ、 この系により分解されるというプロセスはあり得るのでしょうか? 重ねてご質問させていただきます。 よろしくお願いします。