transfection

質問

新しいラボに移ってから、トランスフェクションがうまくいきません。
その原因として、色々と方法を変えたりしたのですがまだうまく安定型発現も一過性発現もうまくいきません。
lipofectamineを用いたtransfectionの効率はmediumのPHにも依存しますか？
今、考えられる原因として、mediumは購入したものではなく、粉から作ってPHをあわせているので（厳密にはあわしていない）、その点が少し気になっています。

回答No.4

Dr_Hyper

あらゆる方法を試されていると言うことなので、いろいろもうしあげても仕方ないかもしれませんが、
リン酸カルシウム法でもCV-1ならかなりの頻度取り込みますし、b-gal染色かGFPの蛍光で観察することでアッセイの問題を排除できますよね。

遺伝子導入効率でもっとも問題になるのはDNAの品質とマイコプラズマだと思います。
あと購入した血清でもpHがおかしくなるものはありますので、ご注意ください。
フェノールレッドは比較的その辺のpHに敏感ですので、いつもよりオレンジだとか、紫だととかでpHを判断できます。
インキュベーターのCO2分圧、血清の影響、試薬の問題などは、いつもと培養液の色が違うかどうかで判断できると思います。で
ちなみに培地は、NaHCO３やグルコースの量なども同一ですか。
思いつくままに補足しましたので、重複などありましたらもうしわけありません。

お礼

丁寧にありがとうございます。
DNAの品質については検討したことがなかったです。
DNAの品質はどういったものがいいんですか？
qiagenのカラムで精製しています。
ただし、室温放置をしてたりもしています。
室温放置というのは影響を与えていますか？

回答No.3

tunertune

うまくいかないのは質問者様だけなのでしょうか？
ラボの他の人はどうですか？
ラボの人で今うまくいかない人がいるなら、昔と変わっていること（試薬等）はありませんか？

お礼

私と先生が今のラボで唯一の経験者です。
後輩は初心者ばかりですが、みんなで頑張っています。
試薬等を疑っていますが、あらゆる問題点を考えてはその対策を考えてやっていますが、まだ実りません。
基本的なことなので早く原因をつきとめて実験をどんどん進めていきたいです。

回答No.2

Dr_Hyper

フェノールレッドの色などはおかしくないのでしょうか？
逸脱していなければそれほど影響が出るとも思えません。
細胞の形態が変わってしまっているなどの影響があれば別ですね。
確かに培養液を新しくあいただけでうまくいくという経験もありますので、pHかもしれないと思うことはありますが、ラボごとにことなるのは、血清、水、インキュベーターの状態、試薬の使用頻度などがありますので、可能であればすべて新しくしてみてトライしてみて、それでもだめであれば検出方法の感度なども疑ってみてはどうでしょうか。
細胞や、検出方法、マイクプラズマのチェックなどの細胞の状態がわかれば、もうすこしお力になれるかもしれません。

お礼

血清は購入したものなので問題ないと思っています。
水は隣の研究室と同じMQを使用しているのでこれも問題ないと考えています（隣のラボはうまくいっているので）。
インキュベーターの状態も疑ったのですが、ひどい扱いをしていないし、頻繁に開け閉めなども行っていないのでそれほど大きな問題だとは思っていません。
試薬の使用頻度も疑い、新しいのを開封したのですがだめでした。
検出方法の感度も、調べましたがそれも原因ではありませんでした。
細胞はCV1細胞、検出方法はpromegaのkitを使用しています。
あらゆる可能性を考えては、やってみたんですが。。。
ちなみに、前のラボではLuc　assayはうまくでていたので手技もそんなにひどくはないと思います。（それも疑って、色々変えてみたのですが無理でした）
新しいラボなのでそのラボのデータがなく、手探りで研究を進めている状態です。
なにか他に原因が考えられるようでしたら、お教えいただけるとありがたいです。よろしくおねがいします。

回答No.1

atyushi

lipofectionで発現せず、これはおかしいとなり
新しくOpti-MEMを買いなおしてやったら
発現するようになりました。
同じOpti-MEMでもロット（使用期間）によって
結果が全然違ったのでメディウムの影響は大きいと思います。

ちなみに
注文したOpti-MEMが届く前に
DMEM（FCS入れない）でもlipofectionで発現しました。

お礼

ありがとうございます。
メディウムを今、一番疑っているのでそれをもう一度PHをあわせてみたいと思います。
これで解決するといいんですが。。。