• ベストアンサー

cDNA Libraryの作成について

cDNA Libraryを市販のキットを使って作ろうと 思うのですが、ファージベクターにインサートの cDNAをいれてライブラリーをつくって、その後 既知の配列のプライマーでPCRをすると、目的の 遺伝子がとれるのでしょうか? おおざっぱですが、教えてください。

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
  • Hayate03
  • ベストアンサー率36% (112/304)
回答No.2

既知配列の遺伝子のcDNA取得が目的であれば、 total RNAの逆転写産物を使ってPCRを行えば良いと思います。 新規遺伝子のcDNA取得が目的であれば、 部分配列や他種生物の配列情報があれば、PCRで取れるかも知れません。 それらの情報がない又は増幅できない場合には、 核酸プローブ、抗体、相互作用タンパク等を使ったスクリーニングが必要になります。

azwagon2
質問者

お礼

ありがとうございます!! 大変参考になりました。また何かわからない ことがあればよろしくお願い致します。

その他の回答 (1)

  • Hayate03
  • ベストアンサー率36% (112/304)
回答No.1

cDNA Libraryを作る目的がよくわかりません。 既知配列のプライマーでPCR増幅して目的の遺伝子を取るのであれば、 Libraryを作る必要はないと思いますが。。 (Libraryにする前のcDNAをそのままPCRに使えば良いのでは?)

azwagon2
質問者

補足

目的は、新規の遺伝子をとりたくてライブラリーを つくろうと思っていました。 けど、ほかにも既知の遺伝子がほしいので、ライブラリー を作ったついでに取ろうかと思いました。

関連するQ&A

  • cDNAライブラリー作製のベクター選択

    初めてcDNAライブラリーを作製しようと思っています。 ある生物体の代謝経路に関与する遺伝子のクローニングを試みており、cDNAライブラリーを作製することにしました。カタログをみるとベクターはファージとかプラスミドとか、その他もありますよね。 インサートサイズが違うということはわかりました。 自分が目的とする代謝経路はまだ不明な点が多く、クローニングもほとんどされていません。ただ唯一クローニングできた遺伝子の長さはcDNAで3kbでした。この場合、プラスミドベクターとファージベクターどちらを選べばいいのでしょうか。 インサートサイズだけ見るとプラスミドの場合、100bp~10kb、ファージベクターが10kbくらいとありましたが、そうするとプラスミドベクターになるのでしょうが、本を見るとファージベクターがほどんどでした。どちらを選んでいいのかわからないのです。 また、プラスミドベクターとファージベクターの長所短所がよくわかっていないのも、選択に迷っている原因だと思います。 生物種や目的遺伝子の表記があいまいでごめんなさい。アドバイス求めています。よろしくおねがいします。

  • cDNAライブラリの使い方や特徴がよくわかりません

    大学の講義でcDNAライブラリーをλファージや大腸菌を使ってcDNAを増やすというようなことを習いました。 ここで下のことがよくわかりません。 ・何かの細胞or組織からmRNAを抽出して作ったものはcDNAライブラリー(それぞれが違うたんぱく質部位をコードしたcDNAの集まり)なのか、それとも同じcDNAばかりが集まったものなのか。 ・cDNAライブラリーとはいろんなcDNAがごちゃまぜで保管されいるのかorあるいは何か容器ごとに「これは…のタンパク質のcDNA、これは…のタンパク質のcDNA・・・・・」というように区分けされて保管されているのか。 ・ライブラリーは既知物を複製するためor未知物の配列を調べるためどちらのためにつかう物なの か? ・前者の場合どうやれば複製した既知物を単離できるのか? つまりそもそも組織からはなんのcDNAが手に入るのかがわかりません。 またcDNAライブラリーは既知物を増やすためにライブラリーから、使うcDNAを取り出すってことなら意味はわかるのですが、未知のたんぱく質の配列を調べるためにつかうのであれば、そのたんぱく質をつくっているmRNAからcDNAなり、なんなりをつくり解析すればいいのではないでしょうか?(だから未知物解析のためならライブラリーは必要ないのではないか) ほかにもいろいろよくわかっていないことがあるのですが、まずこんな初歩の部分ですらよくわかっていません。 解説お願いします。

  • cDNAのクローニングについて

    抗体Aと結合するタンパク質をコードする遺伝子(cDNA)をクローニングする方法を教えてください。 実はこれはある問題で、「PCR、アミノ酸配列、プライマー、精製、データベース」の用語を用いて説明するように書いてあるのですが、インターネットで「cDNAクローニング」といれて検索しても、詳しく中身が書いていなくて、よく分かりません。 自分なりに考えてみると、「タンパク質を精製して、そこからcDNAを抽出し、それをプライマーを用いてPCRで増幅させ、塩基配列を調べて、・・・。」 問題に答えているのか、合っているか分からないですし、行き詰まってしまいます。 タンパク質を精製する方法や、タンパク質からcDNAを抽出する方法があるのかも分かりません。 長々と書いてしまいましたが、よろしくお願いします。

  • TAクローニング後のシークエンスに関して教えてください。

    TAクローニング後のシークエンスに関して教えてください。 生命工学の分野で実験している大学生です。 現在、遺伝子のクローニングを行っています。 ある生物由来のRNAからcDNAを合成し、cDNAをテンプレートとして約1000bpの目的遺伝子をPCRにて増幅、増幅断片をTAクローニングでTAベクターに入れました。 インサートの確認をするため、ベクタープライマーでシークエンスをしましたが、その配列の解読に困っています・・ フォワードのプライマーで読んだ配列は、目的遺伝子配列の相補鎖となっていました。これで、3'側が900bpほど確認できました。しかし、リバースのプライマーで読んだ配列がどうなっているのかよくわかりません・・。 TAクローニングではインサートが逆向きになることがあるとのことですが、これはそのケースでしょうか?その場合、リバースプライマーで読んだ配列はどのような配列になるのでしょうか? 初投稿で読みにくい、説明不足な点もあるかと思いますが回答よろしくお願いします。

  • cDNAライブラリーについて質問です

    cDNAライブラリーから目的とする配列を持つものを選別する方法はどのようにして行うのでしょうか? また、cDNAライブラリーとゲノムDNAライブラリーの違いについて教えてください どなたかご存知の方がいらしたら教えてください よろしくお願いします。

  • TOPOベクタ-に入っているcDNAを制限酵素配列付加プライマーを使っ

    TOPOベクタ-に入っているcDNAを制限酵素配列付加プライマーを使ってPCRで増やし、発現ベクターに入れたいのですが、色々と問題がありそうです。可能でしょうか? 遺伝子工学の初心者です。 2つ質問があります。どちらか一方だけでも良いので、回答よろしくお願いします。 (1)TOPOベクタ-に入っているcDNAを制限酵素で切り出すのではなく制限酵素配列付加プライマーを使ってPCRで増やし、発現ベクターに入れたいのですが、付加する制限酵素の配列がTOPOベクターに存在してしまっています。この場合、非特異産物がでてきてしまうでしょうか?このような手法は一般的ではないのでしょうか?ちなみに、コザック配列をつけるため(制限酵素配列-コザック配列-5´端相補的配列)のプライマーで増やそうとしています。 (2)制限酵素の切断効率を上げるために制限酵素認識配列の両端に数塩基余分な配列を入れるとプロトコルにかいてあり、プライマーの5´端は入れようと思うのですが、制限酵素認識配列の3´側にも入れる必要があるでしょうか? 切断効率は制限酵素認識配列の両端にある塩基の数が重要で、どの塩基かはそれほど重要ではないとか、そんなことはないですか?

  • cDNAからのmiRNAの検出

    はじめまして。 miRNAについては素人なもので、質問させてください。 今、miRNAに関する実験を始めようとしていて、組織や検体における目的のmiRNAの発現量をreal time RT-PCRで調べたいと考えています。 通常、よくやられている方法は、市販されているkitを用いてtotal RNAから逆転写したcDNAを用いていると思います。 そこで質問なのですが。Kit等ではなくて通常の方法で逆転写したcDNA(superscript、randum primer)からmiRNAを検出することは可能でしょうか? それとも、やはりmiRNA用の逆転写を行う必要があるのでしょうか? よろしくお願いします。

  • RT-PCRにおけるプライマー設計について

    はじめてお世話になります。 通常のPCR時におけるプライマー設計は理解できるのですが、RT-PCRにおいては、はじまりが1本鎖のcDNAであるということでひっかかりを感じます。 cDNAの塩基配列がわかっていますのでそれをもとに遺伝子解析系のソフトを用いてプライマーを設計したところ、sense-primerの配列が、cDNAの相補鎖となるものと相補的になっていました。(anti senseのほうはcDNAと相補的だったのですが) 実験書を読むとsenseがまずcDNAとアニールして2本鎖になってから通常のPCRがはじまるというふうに理解できましたので、上記のプライマー設計ではPCRがおこらないということでしょうか? この場合はcDNAの相補鎖に対してプライマー設計をおこなえばよいのでしょうか。 それともこのままのプライマーでよろしいのでしょうか? よろしくお願いいたします。

  • cDNA 定量

    一定量のRNAをインプットして、cDNAを作製した後、リアルタイムPCRに進む前にcDNAの濃度は測定したほうがいいのでしょうか?そうした場合、RT-PCR反応でのランダムプライマーやdNTPは、分光光度計による測定でどの程度影響するのでしょうか?

  • 配列決定について

    いつもお世話になっております。 関連の本を読みましたが、よく分からなかった部分がありました。いくつか教えて下さい。 1. ゲノム配列を決定する際に用いるショットガン法では、ランダムに切断した断片をベクターに導入し、ベクターの既知配列部分をプライマーとして挿入断片の両端から配列決定していき、他の断片との重複から元のゲノム配列を決定する‥‥ことでしょうか。とすると、重複部分を生むために、もとのゲノムDNAは複数用いているのでしょうか?あるいは、ある一個のゲノムに対して、断片化から配列決定までの作業を行い、再度同じ作業を行なっているのでしょうか?  また重複領域がみつからないと断片のつながりが分からないし、かと言って重複ばかりでは全体が見えないという点で、素人ながら効率が悪いようにも感じてしまいます。 2. cDNAの操作について 精製タンパク断片のアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドプローブを作り、cDNAをスクリーニングして、精製タンパクの断片からプライマーを設計してPCRする例が私の教科書にはあるのですが‥‥スクリーニングできたcDNA入りベクターの既知配列(MCS?)をプライマーに使ってPCRするという方法は間違いなのでしょうか? 基本事項ばかりですいません。プロトコールのサイトや本をご存知の方、あるいは一部の回答でもかまいませんので、教えて下さい。