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TLC展開について
いつもお世話になってます。 大学の卒論の実験で、TLC(薄層クロマトグラフィー)を用いた脂質混合物の分離を行ってますがなかなかうまくいかず、不安定なデータが出て困っています。 同じ操作を行って脂質を抽出したはずなのに、TLC展開後の目的バンドの濃さが、同一サンプル同士で異なってしまいます。 TLCで得たバンドの部分をHPLC解析にかけた時、目的産物の量が、同一サンプル間でぶれるので、平均がとれません。。。 TLCで安定しないのはTLC展開前にスポットした量が多すぎるから起こることでしょうか(しかいきちんと濃いバンドが出る場合もあります。)！？ TLCは、1×20cmシリカゲルプレートで行っています。 有機溶媒に飽和させた脂質40～50μlを下から2cmのところに何回かに分けてスポットしてドライヤー(ドライアー)で乾かした後、ベンゼンで展開させています。 濃い濃度の脂質をTLC展開させる際のコツなど、アドバイスいただければ大変うれしいです。
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＞TLCは、1×20cmシリカゲルプレートで行っています。 因みに、厚さは0.25mmの市販のものですか。 ＞TLCで安定しないのはTLC展開前にスポットした量が多すぎるから起こることでしょうか スポットする量が多すぎると分離能が一般に悪くなりますし、キャピラーレ（ヘマトリックス管）を使用してスポットするとばらつきが生じます。 私の経験では、 １：マイクロシリンジで一定量スポットする ２：点でスポットするのではなく帯状にスポットする ３：出来れば（これが結構便利です）、展開層つきのTLC板を使用する。 展開層つきTLC板：TLCの下部に約1cmほどシリカゲルの固定相ではなく濾紙状のものがついている。そこに化合物をスポットすると、展開溶媒により一斉にシリカゲル層まで上げられて同時に展開される便利なTLC板です。市販されています。 参考になればいいのですが。
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質問者からのお礼
ご回答ありがとうございます。 私は生物の実験でよく使うマイクロピペットでスポットしておりますが、やはりばらつきが生じるかもしれません。 >マイクロシリンジで一定量スポット これは良さそうですね！しかし、サンプル数が多いので洗浄時間を考えると今回の場合は少し厳しいです。 >帯状にスポット 今度やってみます！ >展開層つきTLC板 調べて見つからなかったので、分かりませんでしたが、見つけたときに参考にしてみます。当方は学部生なので、今、購入することは難しいです。 今回の実験ではスポットしたときに不純物が混ざっていることがあったので、脂質抽出後の操作に問題があったのかなとも思います。脂質層に水層の物質が混入していると展開がうまくいかないですよね！？
質問者からの補足
>因みに、厚さは0.25mmの市販のものですか。 仰るとおりです。メルク社のシリカゲル60F254をダイヤモンドカッターで切って使用しております。