mRNAのコピー数

質問

1細胞における遺伝子のコピー数ってどうやったらわかるのでしょうか？たとえばハウスキーピング遺伝子とかでもよいのですが。細胞の種類によってももちろん違ってくると思うし。ご存知の方はぜひ教えていただければと思います。

回答No.3

geneticist12

まず、一細胞からRNAをとって分析するのは、PCRが使える現在となっては不可能ではないですが困難です。十分量の細胞や組織を使って、細胞数を計測したりいろいろな方法で推測したりして、一細胞あたりのRNA量に換算するのが普通でしょう。

特定のターゲットmRNAのコピー数を求める方法としては、
1. RNase A protection assay
古典的な方法ですが、おそらく最も定量性がよいです。
in vitro transcriptionなどで、ターゲットRNAの一部に相補な放射性ラベルRNAプローブを作ります。放射性ヌクレオチドの取り込み率から収量が求められますし、一般的な定量法法で収量を求めても良いですが、収量（重量）がわかれば設計したプローブの分子量で除してモル数（これにアボガドロ数をかければコピー数になる）が求められます。モルあたりの比活性も算出できます。

サンプルRNAに過剰量のプローブを加え適当な条件でインキュベートすると、ほぼ100%のターゲットに一分子あたり一分子のプローブがハイブリします。その後、一本鎖RNAを特異的に分解するRNase Aで消化すると、ハイブリしなかった過剰のプローブは分解され、ハイブリしたプローブだけが残ります。分解されなかったプローブの放射活性からハイブリしたプローブのモル数（＝ターゲットRNAのモル数）が求められます。

2. 定量PCR
No. 1さんが書いている通りですが、補足すると、
ターゲットRNA（から逆転写されたcDNA）に対するのと同じプライマーで同程度の増幅をする（つまり長さや配列が極端に変わらない）濃度既知のテンプレートをコンペティターとして加えてPCRをかけます。等量のサンプルに対してコンペティター量を振って、ターゲット由来のPCR産物とコンペティター由来のPCR産物の量が等しくなるポイントを検量線から求めます。そのポイントのコンペティターのコピー数ががターゲットRNAのコピー数ということになります。

ただし、ターゲットRNA量を正確に測定するためには、コンペティターはPCRの段階でプラスミドなどのDNAを加えるのではなく、in vitro transriptionなどで合成したRNAを逆転写の段階から加えるべきです。　なぜなら、逆転写反応はRNAサンプルに対して100%の効率ではなく、しかも反応ごとに効率が振れるものだからです（一般的に10～50%くらいの効率）。

お礼

とても丁寧に回答していただきましてありがとうございます。参考にさせていただきます。

回答No.2

noname#160718

すみません。肝心なところが抜けていました。

５．出たコピー数をテンプレート量と細胞数で計算して、細胞１個あたりのｍＲＮＡ数を算出する

回答No.1

noname#160718

そういう実験はしたことがないので、単に私の知っていることと持っている技術を組み合わせて「私ならこうする」程度のことしか書けませんが。

１．細胞数をカウントする
　　計算盤かパーティクルカウンターか何かで、とにかく単位容積あたりの細胞数を出します。

２．その細胞の単位量から懸濁液を造り、遠心して細胞ペレットを得る

３．そのペレットよりＲＮＡを抽出する

４．目的遺伝子のプライマーを使って、コンペティティブＰＣＲかリアルタイムＰＣＲを実施して、遺伝子のコピー数を出す

　求める精度にもよると思うのですが、これでいけませんかね？
　標準プラスミドを作らなきゃならないのが手間ですが。

お礼

回答ありがとうございます。やはり多数の細胞から平均をとるという形なのですね。ありがとうございます。